源于细菌Dyella caseinilytica的新型N-糖酰胺酶的特性及其功能分析

N-糖酰胺酶(N-glycosidase,PNGase)是一种糖苷水解酶,主要功能为释放糖肽或糖蛋白上的N-糖链,在食品、生物医药等领域中具有重要的应用价值。目前,商业化的PNGase在使用过程中具有一定的局限性,因此,开发性能优良的新型PNGase具有研究意义。该研究在细菌Dyella caseinilytica中利用编码PNGase的基因,通过在大肠杆菌中进行重组表达,成功获得一种新型PNGase,命名为PNGase Dc,该酶分子质量为63.01 kDa。之后对其酶学特性、功能和应用潜力进行分析。酶学特性结果表明,PNGase Dc的最适pH和温度分别为2.0和37℃,酶促反应无金属离子依赖性;此外,该酶稳定性优良,在4℃下保存45 d仍能维持最高活性;分子对接结果表明,PNGase Dc与底物N′N-二乙酰壳二糖的相互作用力以氢键和范德华力为主;定点突变证明,Asp102和Glu236是影响重组PNGase Dc活性的关键氨基酸;PNGase Dc对标准糖蛋白辣根过氧化物酶和牛乳铁蛋白均具有良好的去糖基化效果;最后,以拟南芥和小鼠血浆作为底物评估PNGase Dc应用潜力,证实PNGase Dc在动植物源糖蛋白的研究中具有一定的应用潜力。综上所述,该研究为动植物源糖蛋白的研究提供了一个新的工具酶PNGase Dc,并为该酶的开发利用奠定理论基础。

糖蛋白过敏原N-糖链与过敏的相关性研究

糖蛋白是一种含有寡糖链的蛋白质,糖链与蛋白质之间以共价键相连。N-糖蛋白为常见过敏原之一,主要来源于食物、吸入物、昆虫毒素等,能够引起过敏反应。N-糖蛋白过敏原的N-糖链结构影响过敏原与IgE的结合,影响抗原提呈细胞(APC)对过敏原的识别和提呈。本文在介绍与过敏相关的N-糖蛋白、常见N-糖蛋白过敏原的N-糖链结构及与过敏相关的糖基化酶的基础上,进一步分析过敏原N-糖链影响过敏的机制,为临床预防与治疗过敏性疾病提供新的思路。

鹅颈藤壶多糖提取、理化性质及N-糖链表达谱分析研究

本文以南海海域鹅颈藤壶(Lepas anatifera)为原料,提取鹅颈藤壶背甲与肌肉质柄中的多糖,基于其基本理化性质的分析,比较不同生长时期鹅颈藤壶N-糖链表达谱的差异性。经过脱脂、碱水解/蛋白酶解、乙醇沉淀方法提取得到粗多糖;利用高效液相色谱法、高效凝胶渗透色谱法、苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法对其单糖组成、分子量分布、总糖含量及蛋白质含量进行分析;采用液质分析(PGC-ESI-MS/MS)方法对鹅颈藤壶成体(A-GB)与幼体(L-GB)肌肉质柄中N-糖链进行分析并比较。表明肌肉质柄中多糖分子量为18.40 kDa;总糖含量为11.99%,蛋白质含量60.14%,富含甘露糖、葡萄糖、氨基半乳糖,其中甘露糖的含量高达80%以上。在鹅颈藤壶成体与幼体中均鉴定得到26条N-糖链,成体中高甘露糖型N-糖链占总糖链的20.81%,且相对丰度较高的糖型组成为F_(1)H_(3)N_(2)(39.06%)、F_(1)H_(3)N_(3)(24.44%)、H_(3)N_(3)(9.35%);幼体中高甘露糖型N-糖链占总糖链的52.17%,相对丰度较高的糖型组成为F_(1)H_(3)N_(2)(21.65%)、H_(6)N_(2)(15.93%)、H_(5)N_(2)(14.75%)。鹅颈藤壶多糖是一类N-糖基化的蛋白复合物,推测N-糖链在鹅颈藤壶长发育过程中发挥着至关重要的作用,可能高甘露糖型N-糖链与其附着黏附能力密切相关。

N-糖基化修饰的神经细胞生物学及其在神经系统疾病中的作用

神经发育和神经系统功能受到包括环境、遗传和表观遗传在内的多种因素的调控。N-糖基化修饰是由糖基化转移酶催化形成的蛋白质翻译后修饰,参与多种生物学过程。在神经系统中,N-糖基化修饰高丰度存在,调控神经突触的发育、成熟和胶质细胞的炎症反应。异常N-糖基化修饰与阿尔茨海默病、先天性糖基化障碍、精神分裂症和癫痫等多种神经系统疾病密切相关。本文中我们综述了N-糖基化修饰的神经细胞生物学功能及其在神经系统疾病中的作用和机制。

利用亲水富集策略分析人血浆中N-糖基化蛋白及N-糖类型

蛋白质的N-糖基化是最重要的翻译后修饰之一,许多已知的血浆肿瘤诊断标志物及治疗靶标都是N-糖基化蛋白。针对血浆的糖蛋白质组研究有利于发现新的蛋白标志物。然而,血浆蛋白质浓度分布的动态范围非常宽,且同一位点上的糖链存在微观不均一性,影响了血浆中糖蛋白的鉴定效率。本文利用亲水材料ZIC-HILIC制备亲水富集柱分别对人血浆中的N-糖链和N-糖肽进行富集,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中鉴定到了299个糖基化蛋白、637个糖基化位点,并识别出31种不同的糖型。在这些鉴定到的糖基化位点中,新发现有107个N-糖基化位点(占总位点数的16.8%)。本方法操作简单,可以有效富集N-糖肽和N-糖,为在血浆中寻找糖蛋白和糖链生物标志物提供了可靠的手段。

植物N-糖链检测技术研究进展

N-糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰,在胚胎发育、癌症发生发展及免疫防御等诸多复杂的生命活动中发挥着关键作用。近年来,基于质谱的N-糖链的检测及其定量研究在动物方面取得了显著进展,相比之下,植物N-糖基化及N-糖链检测的相关研究要远远滞后,这也是制约植物糖生物学研究发展的关键瓶颈问题之一。对蛋白质N-糖链的释放、定量策略、可视化检测及其在植物中的应用进展进行了归纳总结,以期为指导后续植物N-糖链及N-糖组的定性定量检测提供参考。

新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料的合成及其在蛋白质N-糖链富集中的应用

蛋白质的N-糖基化修饰与多种重要的生理、病理进程密切相关,是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。由于糖蛋白本身多是低丰度表达的蛋白质,且糖链结构具有高度微不均一性,这使得蛋白质糖基化修饰的分析具有一定的挑战。本研究利用表面引发-原子转移自由基聚合(SI-ATRP)法,以带有双键的氨基葡萄糖为单体(GMAG),成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料(pGMAG-SiO2)。由于在硅胶表面引入致密的亲水聚合物层,该填料不仅保持了硅胶良好的机械强度,而且显著提高了其亲水性,因此非常适合作为亲水填料用于蛋白质的N-糖链富集。以麦芽七糖和鸡卵清蛋白的N-糖链为研究对象,考察了该填料对N-糖链的富集效果,并将该杂化填料成功用于人血浆中糖蛋白N-糖链的富集检测,共鉴定了47种糖型。以上结果表明,pGMAG-SiO2填料对N-糖链具有较高的亲和性,可以用于N-糖链的高覆盖率鉴定。

原发性肝细胞癌患者血清N-糖组的表达分析

目的:通过对厚发性肝细胞癌(HCC)与正常人血清N-糖组图谱比较分析,寻找异常峰,为寻求新的HCC肿瘤标志物奠定基础。方法:收集乙型肝炎病毒(HBV)感染的HCC患者(n=100)及健康献血员(n=130)血清,采用基于DNA测序仪的毛细管电泳技术,检测每份标本中荧光标记的N-糖组分。结果:每份血清均得到具有11个峰的图谱,峰值经校正后量化,HCC组较对照组峰1、2、9、11升高,蜂6、8、10降低(P<0.05);且部分峰值变化与肿瘤标志物甲胎蛋白、HBV DNA载量、临床肝功能指标存在相关性。结论:HCC组血清N-糖组图谱较正常对照存在明显的差异,这种变化有望为临床疾病诊断提供依据。

基于电喷雾电离质谱的人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的N-糖链的定性定量比较

以培养的原发性肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02为研究对象,采用细胞裂解液提取总蛋白,用PNGase F酶解释放N-糖链,以微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化分离N-糖链,通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对N-糖链进行序列鉴定,以β-环糊精为内标对2种细胞系的N-糖链进行了定量比较分析.结果表明,在肝癌细胞系HepG2和正常细胞系L02中共检测到26种N-糖链,与L02相比,HepG2的大多数高甘露糖型糖链、唾液酸化糖链和岩藻糖基化糖链的数量都明显升高,其中有15种糖链在数量上具有极显著性差异(p<0.01),1种糖链具有显著性差异(p<0.05).本研究为进一步探索肝癌中各类N-糖链的表达特点及发现早期肝癌糖链标志物提供了参考.

原发性支气管肺癌患者血清中N-糖组学改变

目的:探索肺癌患者、正常人群以及良性肺病患者血清N-糖组图谱差异性表达,为寻找新的肺癌相关肿瘤标志物奠定基础。方法:收集105例肺癌患者、71例健康对照者以及43例良性肺病患者血清,采用DSA-FACE技术检测血清样本的N-糖组图谱。结果:(1)3组间有8个峰值差异存在显著性:与对照组相比,肺癌组peak1、5、9升高,Peak3、6、11降低(P<0.05)。与良性肺病组相比,肺癌组Peak5、9升高;Peak3、4、11降低(P<0.05)。(2)肺癌组中,不同的TNM分期、年龄及性别与N-糖链均具有一定的相关性。结论:肺癌患者血清N-糖组图谱具有特征性表达,其作为肺癌诊断标志物具有一定的诊断性能和潜在价值,还需进行大样本的深入研究。

基于MALDI-TOF质谱技术分析人宫颈癌HeLa细胞N-糖链结构轮廓

以微量HeLa细胞(107个)为对象,经细胞裂解、还原羧甲基化、胰酶降解和Oasis-HLB柱提取分离得到总糖肽后,用PNGase F酶解释放N-糖链.对所得N-糖链用Sep-Pak C18柱纯化后进行完全甲基化衍生,再采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析HeLa细胞表面N-糖链的结构轮廓.结果表明,在获得的34种N-糖链中,除高甘露糖型、二天线、三天线、四天线和五天线等N-糖链外,还出现了在某种程度上与肿瘤发生转移相关的特殊平分型和Lewis结构.利用MALDI-TOF MS技术可快速分析微量癌细胞表面N-糖链的结构轮廓,为进一步寻找肿瘤糖链标志物及肿瘤的早期预防诊断提供技术支持.

微量生物样品中糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立

基于电喷雾电离质谱检测技术,建立了一种可靠、高效、简单,适合于微量糖蛋白N-糖链解离、富集纯化的方法。以糖蛋白牛胰核糖核酸酶(Rib B)和卵清白蛋白(OVA)为模型蛋白直接酶解,比较了4种方法纯化酶解样品的效果。比较了直接酶解和经过聚偏氟乙烯(PVDF)膜富集后酶解微量复杂生物来源样品胎牛血清的酶解效果,最终建立了微量生物样品中糖蛋白N-糖链的质谱分析前处理方法。采用PVDF膜吸附复杂生物样品中的糖蛋白,N-糖苷酶F(PNGase F)酶直接在膜上完成糖链释放(37℃,24 h),采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化,用于微克级胎牛血清和健康人血清中N-糖链质谱分析的前处理。本方法通用性好,在微量生物样品糖链质谱分析检测的前处理方面具有一定应用价值。

甲胺化衍生结合基于硅氢化物固定相的正相色谱用于单克隆抗体药物的N-糖基化表征

采用甲胺化衍生结合基于硅氢化物固定相的正相色谱(SiH-NPC)分析单抗的N-糖基化。样品经酶切、甲胺化衍生、纯化后由液相色谱-质谱进行分析。结果表明,相较于亲水相互作用色谱(HILIC),SiH-NPC分离机制不同,使用常规的无盐流动相即可实现高分离度,避免污染质谱,色谱柱结构稳定,使用寿命长,更适合快速分析。结合唾液酸衍生方法,SiH-NPC在液相色谱-质谱联用鉴定酸性糖和糖异构体方面呈现显著优势,在生物制药行业中具有重要的应用潜力。

N-糖链合成抑制剂对NIH3T3细胞粘附作用和整合蛋白表达的影响

研究了Ｎ－糖链合成抑制剂——Ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＭＭ）和衣霉素（ＴＭ）对ＮＩＨ３Ｔ３细胞粘附作用和细胞表面α５β１整合蛋白含量的影响．研究结果发现甘露糖苷酶Ⅰ抑制剂－ＤＭＭ处理ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，３Ｈ－甘露糖（３Ｈ－Ｍａｎ）参入ＮＩＨ３Ｔ３细胞较对照细胞增加一倍，多天线复杂型糖链增加１８％，而细胞表面α５β１整合蛋白与纤连蛋白粘附能力却下降１７％，但对膜整合蛋白α５和β１亚基表达量无明显影响，提示不成熟的糖链对整合蛋白参与的细胞粘附功能有一定影响，但不影响糖蛋白运输及整合到膜上．十四糖二磷酸长萜醇合成抑制剂——ＴＭ为０．５μｇ／ｍｌ时，Ｎ－糖链合成显著抑制，３Ｈ－Ｍａｎ参入减少了５２％，细胞粘附能力下降了３７％，细胞表面膜整合蛋白α５亚基下降了２２％，而β１亚基无明显变化，提示ＴＭ的脱糖基化作用可引起α５亚基转运至细胞膜表面下降，以至影响了细胞的粘附能力．此外，脱糖整合蛋白与纤连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｆｎ）的结合力下降也是原因之一．

肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体N-糖链结构与功能的变化

探讨肝癌细胞与正常肝细胞 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR)N 糖链结构与功能的差异 .采用流式细胞术检测SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞膜表面 6 7LR的表达 ,并分别从这 2株细胞分离纯化到高亲和力的 6 7LR ,利用凝集素结合分析其糖链结构 ,并用肽 N 糖苷酶水解N 糖链 ,观察糖链在与层粘连蛋白结合过程中的作用 .结果发现 ,L 0 2细胞膜表面 6 7LR表达的阳性率为5 5 3% ,而SMMC 772 1细胞为 34.7% ,这两株细胞 6 7LR与伴刀豆素 (ConA)的结合能力无显著差异 ,但SMMC 772 1细胞的 6 7LR与麦胚凝集素的结合能力明显高于L 0 2细胞的 6 7LR ,说明 2株细胞 6 7LR的糖链结构存在显著差异 .当N 糖链被切除后 ,SMMC 772 1细胞的 6 7LR与层粘连蛋白的结合能力明显下降 ,而L 0 2细胞则没有变化 .这些资料表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白结合能力的差别 ,以及两株细胞的 6 7LR与层粘连蛋白结合能力的不同 ,很可能是由于这两株细胞的层粘连蛋白受体的N

肾小球系膜细胞中Β_1整合素表达及细胞凋亡与N-糖链抑制剂关系的研究

目的观察N-糖链抑制剂衣霉素(TM)对肾小球系膜细胞(GMC)增殖、凋亡的影响以及Β1整合素和CYCLIN D1表达在细胞凋亡以及细胞增殖中的作用。方法体外培养的大鼠GMC分四组:正常对照组,0.5、1.0和2.0ΜG/ML衣霉素组。采用流式细胞技术测定Β1整合素水平和细胞凋亡率,细胞免疫化学方法测定CYCLIN D1表达,MTT法测定细胞增殖能力。结果TM作用以后,细胞Β1整合素水平降低,细胞凋亡率增加,同时细胞周期正调控蛋白CYCLIN D1表达下降,增殖能力降低,这种作用呈剂量依赖性。结论N-糖链抑制剂TM通过抑制Β1整合素的表达,影响细胞的粘附而导致细胞凋亡,并影响细胞周期正调控蛋白CYCLIN D1表达,使细胞增殖能力受抑,这种作用呈剂量依赖性。

N-糖链抑制剂对高糖刺激鼠肾系膜细胞粘着斑激酶表达及透明质酸分泌的影响

目的 :观察N 糖链抑制剂衣霉素 (TM)和 1 deoxymannojirimycin (DMM)对高糖刺激肾小球系膜细胞(GMC)增生、粘着斑激酶 (FAK)表达及透明质酸 (HA)分泌的影响。 方法 :体外培养大鼠GMC ,分为七组 :正常组 ,高糖组 ,甘露醇组 ,高糖加衣霉素组 ,高糖加DMM组 ,并设TM、DMM对照组。采用四唑盐比色 (MTT)法测定细胞增生 ,免疫组织化学方法测定粘着斑激酶 (FAK) ,放射免疫法测定透明质酸 (HA)含量。 结果 :高糖可诱导GMC增生、增加FAK表达及HA分泌。相对于正常培养条件下生长的GMC ,N 糖链抑制剂TM和DMM对高糖作用条件下的GMC增生、FAK活性及HA分泌有更为明显的抑制作用。 结论 :N 糖链抑制剂TM和DMM可通过阻断糖链的合成和改变糖链类型抑制高糖诱导的细胞增生、FAK活性及HA分泌的作用。

N-糖苷酶基因在脑膜炎败血伊丽莎白金菌临床分离株中的分布

N‐糖苷酶（PNGase）是真核生物中的常见酶，但在原核生物中极为罕见，目前仅报道在脑膜炎败血伊丽莎白金菌（EM）中存在。本文旨在检测 PNGase基因在EM临床分离株中的分布，为该菌的亚型分类及快速核酸分子检测提供依据，为研究PNGase在原核生物中的生物学功能奠定基础。于2010年7月～2012年12月收集浙江省3家三级甲等医院的65株EM临床分离株，提取细菌基因组 DNA ，利用16 S rRNA细菌通用引物、PNGase F和PNGase F‐Ⅱ特异性引物，进行组合聚合酶链反应（PCR）。阳性扩增产物测序后与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中已知EM序列比对确认。结果显示，PNGase阳性菌64株，总阳性率为98．5％；PNGase F和PNGase F‐Ⅱ共阳性菌39株，共阳性率为60．0％。 PNGase F阳性菌41株，阳性率为63．1％；PNGase F‐Ⅱ阳性菌62株，阳性率为95．4％，PNGase F‐Ⅱ阳性率高于 PNGase F （配对χ^2检验， P＜0．01），提示 PNGase可能对EM具有重要的生物学意义。结果还表明，本研究建立的组合PCR可应用于E M菌株中 PN G ase基因分型。

骨髓基质细胞中MGAT3催化的平分型N-糖链对血液细胞黏附和迁移的影响

骨髓基质细胞是造血微环境的重要组成之一,在促进造血干细胞生成血细胞的各个环节中起着十分重要的作用。研究了人骨髓基质细胞HS5中抑制平分型N-糖链的表达,并观察其对共培养体系中血液细胞黏附和迁移的影响。利用基因工程技术在HS5中沉默平分型N-糖链合成中的关键酶,即N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(MGAT3),用凝集素染色检测发现沉默MGAT3后HS5中平分型N-糖链的表达量降低。通过共培养发现,HS5中的平分型N-糖链降低后,血液细胞KG1a和PL-21对HS5的黏附能力降低,迁移能力也随之降低。由此表明,平分型N-糖链参与的骨髓造血微环境对调控血液细胞黏附和迁移方面有重要的生物学功能。

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。