基于肼化学富集法分析人血浆外泌体中的N-糖基化蛋白质

目的对人血浆外泌体中N-糖基化蛋白质的组成和功能进行分析。方法通过超速离心法分离获得健康人血浆外泌体,超声处理获得外泌体蛋白,胰蛋白酶将蛋白酶解为肽段。肼化学法分离富集血浆外泌体中的N-糖基化肽段,液相色谱及高分辨质谱对其进行鉴定,基因本体法对鉴定的N-糖基化蛋白质的生物学功能进行分析。结果获得的外泌体具有外泌体典型的茶托样双层膜结构,形态完整,大小均匀,直径分布在100 nm左右。在1 mL健康人血浆外泌体中共鉴定到252个N-糖基化修饰位点,归属于131个N-糖基化蛋白质。可能在丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性抑制及钙离子结合等生命过程中发挥重要作用。其中,67个N-糖基化蛋白质与疾病的发生发展密切相关。结论本研究在人血浆外泌体中共鉴定到131个N-糖基化蛋白质。它们可能参与关键的生命活动及疾病的发生发展。

新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料的合成及其在蛋白质N-糖链富集中的应用

蛋白质的N-糖基化修饰与多种重要的生理、病理进程密切相关,是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。由于糖蛋白本身多是低丰度表达的蛋白质,且糖链结构具有高度微不均一性,这使得蛋白质糖基化修饰的分析具有一定的挑战。本研究利用表面引发-原子转移自由基聚合(SI-ATRP)法,以带有双键的氨基葡萄糖为单体(GMAG),成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料(pGMAG-SiO2)。由于在硅胶表面引入致密的亲水聚合物层,该填料不仅保持了硅胶良好的机械强度,而且显著提高了其亲水性,因此非常适合作为亲水填料用于蛋白质的N-糖链富集。以麦芽七糖和鸡卵清蛋白的N-糖链为研究对象,考察了该填料对N-糖链的富集效果,并将该杂化填料成功用于人血浆中糖蛋白N-糖链的富集检测,共鉴定了47种糖型。以上结果表明,pGMAG-SiO2填料对N-糖链具有较高的亲和性,可以用于N-糖链的高覆盖率鉴定。

不同性别人群的蛋白质N-糖基结构谱型比较

目的对不同性别人群的血浆N-糖基结构谱型进行分析比较,为基础人群N-糖基结构的分布提供科学依据。方法采用整群抽样,以2009年4~7月在北京某社区调查的212名居民为研究对象,基于高效液相色谱法进行血浆糖基组检测。不同性别的糖基含量比较采用两独立样本t检验或非参检验,P〈0.05为差异有统计学意义。结果 212名研究对象的平均年龄为（37.78±17.89）岁,性别比为0.88。半乳糖基化修饰水平,男性双触角非半乳糖聚糖水平略高（Z=2.33,P=0.02）,女性单半乳糖聚糖水平较高（t=-2.06,P=0.04）。岩藻糖基化分析显示,女性核心岩藻糖化聚糖水平略高（t=-2.16,P=0.03）。唾液酸糖基化水平中,女性单唾液酸糖基化水平较高（t=-2.43,P=0.02）,男性二唾液酸糖基化水平较高（t=2.11,P=0.04）。结论血浆N-糖基结构水平可能存在性别决定性。

凝集素法与酰肼法富集糖肽的方法学比较

蛋白质糖基化(glycosylation)是最常见和最重要的翻译后修饰之一.大规模N-连接糖基化位点鉴定是糖蛋白质组学研究的重要组成部分,而N-连接糖肽富集是高通量N-连接糖基化位点鉴定的关键步骤.凝集素富集法和酰肼化学法是目前被广泛应用的N-连接糖肽富集技术,有报道认为两种方法具有很强的互补性,联合使用能提高糖基化位点的鉴定数目.本文以Hep G2细胞系为模型,系统比较了这两种方法的富集效率和糖蛋白鉴定数目.结果表明,虽然酰肼法的糖肽富集效率为76.6%,远高于凝集素法的54.6%,但是凝集素法却能鉴定到825个糖蛋白和1 959个N-连接糖基化位点,显著多于酰肼法富集到的522个糖蛋白和1 014个糖基化位点.并且,两种方法并未显示出显著的互补性,仅28个糖蛋白和80个糖基化位点未在凝集素法中鉴定到.