麻疯树核糖体失活蛋白Curcin和Curcin C的RNA N-糖苷酶活性研究

为探究麻疯树核糖体失活蛋白的RNA N-糖苷酶活性,本研究建立了UPLC-MS/MS方法测定麻疯树核糖体失活蛋白Curcin、Curcin C的体外RNA N-糖苷酶脱嘌呤活性.通过单因素实验得到Curcin与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=4.2、反应时间为4 h.当Curcin C与RNA32脱嘌呤反应时,反应的最适条件为37℃、pH=3.7、反应时间为8 h.Curcin的K_(m)值为8.231μmol/L,Curcin C的K_(m)值为3.302μmol/L,说明Curcin C与底物的亲和力更大.部分金属离子对CurcinC的酶活性具有促进作用,而对Curcin而言均产生了抑制.腺苷浓度达到250μmol/L时,Curcin C酶活性升高,而对于Curcin没有影响.当酶促反应底物为RNA14和RNA32时,Curcin C蛋白的RNA N-糖苷酶活性都显著高于Curcin,表明Curcin C相较于Curcin更具有抗肿瘤药物开发潜力.

天花粉蛋白的作用机制——RNA N-糖苷酶型

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类广泛分布于植物界的能抑制真核细胞核糖体功能的毒蛋白。其作用的分子机制有两类:(1)RNA水解酶型,如帚曲霉素(α-sarcin),专一水解28SrRNA第4325—4326位之间的磷酸二酯键;(2)RNA N-糖苷酶(RNA N-glycosidase)型。

N-糖苷酶基因在脑膜炎败血伊丽莎白金菌临床分离株中的分布

N‐糖苷酶（PNGase）是真核生物中的常见酶，但在原核生物中极为罕见，目前仅报道在脑膜炎败血伊丽莎白金菌（EM）中存在。本文旨在检测 PNGase基因在EM临床分离株中的分布，为该菌的亚型分类及快速核酸分子检测提供依据，为研究PNGase在原核生物中的生物学功能奠定基础。于2010年7月～2012年12月收集浙江省3家三级甲等医院的65株EM临床分离株，提取细菌基因组 DNA ，利用16 S rRNA细菌通用引物、PNGase F和PNGase F‐Ⅱ特异性引物，进行组合聚合酶链反应（PCR）。阳性扩增产物测序后与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中已知EM序列比对确认。结果显示，PNGase阳性菌64株，总阳性率为98．5％；PNGase F和PNGase F‐Ⅱ共阳性菌39株，共阳性率为60．0％。 PNGase F阳性菌41株，阳性率为63．1％；PNGase F‐Ⅱ阳性菌62株，阳性率为95．4％，PNGase F‐Ⅱ阳性率高于 PNGase F （配对χ^2检验， P＜0．01），提示 PNGase可能对EM具有重要的生物学意义。结果还表明，本研究建立的组合PCR可应用于E M菌株中 PN G ase基因分型。

天花粉蛋白Glu160在N-糖苷酶活性中的作用

用浸泡法得到了（Ｅ１６０Ａ）天花粉蛋白（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， ＴＣＳ），（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ与Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ与ＦＭＰ复合物的晶体．在Ｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 面探测器系统上分别收集了０．２０ ｎｍ ，０．１９ｎｍ 和０．２０５ ｎｍ 分辨率的Ｘ 射线衍射数据，数据处理用Ｍａｒ Ｓｃａｌｅ 程序系统完成．用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－Ａｄｅ，（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ－Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－ＦＭＰ的晶体结构，结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序，修正结果，晶体学Ｒ因子分别为０．１６６，０．１７６，０．１７９．键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１０ ｎｍ 和２．５０３°，０．００１３ ｎｍ 和２．６６５°，０．００１２ ｎｍ 和２．６７６°．在这三个结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变．Ａｄｅ 或ＦＭＰ仍结合在Ｎ－糖苷酶活性口袋之中，它夹在Ｔｙｒ７０和Ｔｙｒ１１１两个侧链环之间，与Ｔｙｒ７０环近乎平行．这一结果表明：ＴＣＳ中的Ｇｌｕ１６０分别突变成Ａｌａ 和Ａｓｐ，仍能与ＡＭＰ发生Ｎ－糖苷酶反应，但是活性降低了一些．可见Ｇｌｕ１６０对ＴＣＳ与ＡＭＰ的作用是重要的，但不是必要的．

天花粉蛋白Glu189在N-糖苷酶活性中的作用

培养了(E160A,E189A)TCS(天花粉蛋白)的单晶。用浸泡法得到了(E160A,E189A)TCS与Ade复合物的晶体。在MarResearch面探测器系统上分别收集了均为0.20nm分辨率的X射线衍射数据,数据处理用MarScale程序系统完成。用同晶差值Fourier法解析了(E160A,E189A)TCS和(E160A,E189A)TCS-Ade的晶体结构,结构修正利用X-PLOR程序.修正结果,晶体学R因子分别为0.180、0.184,键长和键角的RMS偏差分别为0.0012nm和2.566°、0.0012nm和2.622°。在(E160A,E189A)TCS-Ade中,Ade仍结合在N-糖苷酶活性口袋之中,它夹在Tyr70和Tyr111两个侧链环之间,与Tyr70环近乎平行。这一结果表明:TCS中的Glu160和Glu189同时突变成Ala,仍能与AMP发生N-糖苷酶反应.前文已经证明在(E160A)TCS中Glu189没有援救作用。目前,没有发现Glu189对TCS与AMP的直接作用,但Glu189与其它残基的协同作用及其在TCS与rRNA作用中扮演什么角色,尚待进一步研究。

质子化和低能电子俘获对N-糖苷键解离性质影响的理论研究

采用B3LYP密度泛函方法,在6-311++G(2d,2p)基组水平上,对3种嘌呤核苷体系及其N7-质子化和低能电子俘获形成的衍生物结构性质、键解离能、水解机理进行了计算调查.计算结果显示,质子化嘌呤核苷与中性嘌呤核苷的水解机理并不相同,且质子化可以明显减少N-糖苷键离子解离通道所需要的能量,降低其水解活化能,稳定水解产物,极大地促进N-糖苷键的水解.与质子化作用类似,嘌呤核苷俘获低能电子,也能显著地降低N-糖苷键的键解离能,显著地影响嘌呤核苷的稳定性.

核糖体被RNA N-糖苷酶失活以后的活力恢复

核糖体失活蛋白(RIP)是一类专一作用于核糖体RNA(rRNA)而抑制蛋白质生物合成的核毒素(Ribotoxin),其作用机理可分为核酸水解酶(如α-sarcin)及RNA N-糖苷酶两种类型(如Ricin A-链)。在大鼠肝核糖体28S RNA的4786个核苷酸中,RNA

天花粉蛋白N-糖苷酶作用的机制

用晶体学方法分别研究了TCS与AMP ,Ado ,tub ,CMP的相互作用 .确证了TCS专一性识别Ade,嘧啶环不识别 ,而用TCS与单核苷酸作用 ,磷酸根存在与否并不重要 ;R1 6 3胍基的H+被Ade的N3共享 ,而不是N7接受质子 .丰富了TCS与AMP相互作用的N 糖苷酶作用机制模型 .此模型也应该适用于RIPs与AMP的相互作用 ,反映了RIP与rRNA作用的基本模式 ,但是 ,RIP与rRNA的作用会更复杂 ,要全面了解RIPs对rRNA的识别与催化 ,还应该探索RIP与rRNA中包括GAGA茎环区底物类似物复合物的三维结构 .

新一类抗肿瘤药物N-糖苷类化合物的光化学活性

N-糖苷类化合物以其无毒和高效抗肿瘤活性而成为当今研究的热点.本研究应用时间分辨激光光解技术,详细研究了N-(α-D-吡喃型葡萄糖苷)水杨酰肼(N-(α-D-glucopyranoside)salicyloyl hydrazine,NGSH)在激光脉冲的作用下所产生的各种瞬态物种的行为.结果表明,在266nm的激光作用下,NGSH可发生单光子电离,其量子产率为0.02,光致电离效率较高,在细胞的含氧体系中,水合电子很容易跟O2结合生成超氧阴离子自由基和单线态氧,这二者是杀灭肿瘤细胞最强的活性物质.NGSH光电离产生的阳离子自由基可以脱去质子生成中性自由基,其pKa为4.02,NGSH+·的衰减速率常数为2.55×109dm3·mol-1·s-1.用SO-4-自由基氧化NGSH,得到NGSH+·的生成速率常数为k=1.76×109dm3·mol-1·s-1,进一步验证了光电离结果.

N-糖苷的化学合成

介绍了近年来N-糖苷的合成方法和N-糖苷化学合成的前景和发展方向。

简并引物法克隆保加利亚乳杆菌β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(β-Hexcase)在细菌、植物和动物中广泛存在,具有典型的外切酶活性并可以催化切除β-N-乙酰氨基己糖的非还原性氨基己糖残基,在细菌细胞分裂中具有重要作用.选取与保加利亚乳杆菌LJJ亲缘关系近的菌种的β-N-乙酰氨基己糖苷酶蛋白序列,利用ICO-DEHOP和CODEHOP在线简并引物设计软件设计β-Hexcase简并引物,选取Hex1-f和Hex1-r引物对,以LJJ基因组DNA为模板经PCR扩增得到614 bp产物.PCR产物连接pGEM-T质粒载体后克隆至大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆提取质粒进行测序.测序结果显示产物长度为614 bp,该DNA序列经blastx比对发现与其他已知β-Hexcase基因具有相似性,表明所克隆的序列即为LJJβ-Hexcase的基因片段.β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的获得为进一步研究β-N-乙酰氨基己糖苷酶与保加利亚乳杆菌自溶的关系奠定了基础.

N-乙酰-β-D氨基葡糖苷酶在肾病早查中的临床意义

目的探讨N-乙酰-β-D氨基葡糖苷酶(NAG)检测在肾病早查中的临床意义。方法分析28例IgA肾病患者的临床及病理资料,探讨肾小球及间质病理损害程度与NAG的关系。结果肾小管间质损害情况:肾小管间质损害轻度者占46.43%,中重度者占32.14%,无肾小管间质损害者21.43%。肾小管间质损害与NAG的关系:肾小管间质损害中、重度者尿NAG酶(5.141±1.821)U/(mmol.cr);小管间质损害轻度者尿NAG酶(1.659±1.485)U/(mmol.cr);无肾小管间质损害者尿NAG酶(1.447±1.816)U/(mmol.cr)。小管间质中重度损害者同其他两组比较,其尿NAG酶有显著统计学差异,P<0.05。结论 IgA肾病常合并小管间质损害,肾小管功能中尿NAG酶改变与肾脏小管间质损害程度成对应关系。

糖尿病患者血尿酸、肌酐及尿N-乙酰-β-D氨基葡糖苷酶的相关性研究

目的探讨糖尿病(DM)患者血尿酸、血肌酐、尿N-乙酰-β-D氨基葡糖苷酶(NAG)测定的相关性。方法检测62例糖尿病患者[尿微量白蛋白正常(尿微量白蛋白<30mg/24h)41例(DM-1组)、升高(30mg/24h<尿微量白蛋白<300mg/24h)21例(DM-2组)]血生化(尿酸、肌酐)指标及尿NAG水平,并对尿NAG与血生化指标(尿酸、肌酐)的相关性进行分析。结果 DM-2组尿NAG均显著高于DM-1组(P<0.01),其升高与血尿酸呈正相关,与血肌酐无明显相关性。结论尿NAG在早期预测与筛选糖尿病肾病(DN)方面灵敏度高,是DN的早期诊断有价值的指标。

血清C肽、糖化血红蛋白与N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶联合检验在诊断2型糖尿病早期肾损伤中的应用

目的探讨血清C肽、糖化血红蛋白与N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶联合检验在诊断2型糖尿病早期肾损伤中的应用。方法选择2018年1月~2019年6月我院收治的50例2型糖尿病早期肾损伤患者作为为研究组,另选取同时间段收治的50例单纯2型糖尿病患者作为对照1组,另选取同时间段来我院进行常规体检的50例自愿者作为对照2组。三组均接受血清C肽、糖化血红蛋白与N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶联合检验诊断,并进行比较分析。结果研究组的糖尿病病程长于对照1组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组的空腹血糖、尿微量白蛋白/肌酐比值水平均高于对照1组、对照2组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组的糖化血红蛋白、N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶水平均高于对照1组、对照2组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组的血清C肽水平低于对照1组、对照2组,差异有统计学意义(P<0.05);对照1组的空腹血糖、尿微量白蛋白/肌酐比值水平均高于对照2组,差异有统计学意义(P<0.05);对照1组的糖化血红蛋白、N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶水平均高于对照2组,差异有统计学意义(P<0.05);对照1组的血清C肽水平低于对照2组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在临床检查诊断糖尿病早期肾损伤过程中,应用血清C肽、糖化血红蛋白与N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶联合检验方法可以起到有效作用,能够提供准确检查诊断参考依据,具有重要应用价值。

肽N-糖苷酶的动力学分析方法

肽N-糖苷酶(peptide N-glycanase,PNGase,在人体中称为NGLY1)几乎存在于所有的活细胞中,可以催化切断糖蛋白或糖肽上天冬酰胺与N-糖链之间的糖苷键,被作为工具酶,广泛应用于糖蛋白组学研究中。同时,NGLY1在内质网相关的降解过程中是必不可少的,NGLY1缺乏可能会导致先天性糖基化障碍。酶促反应动力学的研究有助于发现或定向进化更丰富的工具酶以用于不同的分析策略,研究NGLY1突变型与疾病的关系,探索相关疾病机制或治疗策略。本文介绍了PNGase的发现、生理病理功能及其在糖蛋白组学中的应用,重点阐述各种PNGase动力学分析方法,包括比色法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法和液相色谱-质谱联用法,并总结了这些分析方法的优势和不足,为今后开发更简便、灵敏度更高的PNGase的动力学分析方法提供启发。

2型糖尿病患者尿N-乙酰-β—D一氨基糖苷酶和尿微量白蛋白联合检测在早期肾损伤诊断中的价值

目的探讨尿N-乙酰-β-D-氨基糖苷酶（尿NAG）、尿微量白蛋白（尿MAlb）对2型糖尿病早期肾损伤的诊断价值。方法2型糖尿病组60例，正常X,JN组30名，分别用速率法和免疫透射比浊法检测尿NAG、尿Malb。结果糖尿病组尿NAG20．14±13．3U／L、尿MAlb39．8±33．Img／L，对照组分别为5．34±1．2U／L、4．4±2．3mg／L，糖尿病高组于正常对照组3～9倍，，检验差别有高度统计意义（P〈0．01）；糖尿病组尿NAG阳性率88．3％、尿MA｜b81．6％，X^2检验差异无显著性（P〉0．05）；两两比较尿NAG、尿MAIb各自灵敏度100％、90．7％；特异性87．8％、100％；准确性均为94．4％。结论尿NAG、尿MAIb联合检测可提高糖尿病早期肾损伤诊断的敏感性与特异性。

链球菌gordonii FSS2 N-乙酰氨基葡糖苷酶基因的克隆和表达

目的 :N -乙酰氨基葡糖苷酶 (N -acetylglucosaminidase)是链球菌gordonii六种胞外糖苷酶之一。为研究该酶 ,克隆和表达该基因片段。方法 :将链球菌gordoniiFSS2染色体DNA分离提纯 ,用限制性内切酶Sau 3AI不完全酶切 ,产生长度不等的随机片段 ,琼脂糖凝胶电泳分离和回收 2 - 8kpb的随机片段 ,然后与BamHI线性化及 5’端脱磷处理的载体pUC 18连接 ,转化大肠杆菌XL1-Blue;β—半乳糖苷酶筛选系统及酶切 ,检测插入片段。根据N -乙酰氨基葡糖苷酶与特异人工底物X -GlucNac反应 ,有色物质X被释放原理 ,筛选表达克隆。结果 :共有 6×10 6个转化子 ,约 5 0 %转化子含有插入片段 ;检测到 8个N—乙酰氨基葡糖苷酶表达克隆。结论 :所构建的基因组文库具有完整性 ,该基因在大肠杆菌XL1-Blue中成功表达。

核糖体RNA拓扑学与RNAN－糖苷酶研究进展（下）

２８ＳｒＲＮＡ的α－ｓａｒｃｉｎ结构域直接参与核糖体催化的蛋白质合成反应，已经证明天花粉蛋白是一种ＲＮＡＮ－糖苷酶，一种测定ＲＮＡＮ－糖苷酶活力的新方法也已初步建立。天花粉蛋白能使超螺旋ＤＮＡ解旋并断裂为缺口环状和线状ＤＮＡ．并已发现其它ＲＮＡＮ－糖苷酶也具有这一核酸内切活性。天花粉蛋白对２８ＳｒＲＮＡ，超螺旋ＤＮＡ和艾滋病毒（ＨＩＶ－１）ＲＮＡ三种底物可能有相同的分子作用机制．

N－糖苷键型糖蛋白与肺癌诊断的初步研究

为探讨Ｎ－糖苷键型糖蛋白在肺癌诊断中的意义。取肺鳞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞癌术后切除新鲜癌组织匀浆混匀，提取蛋白质并标记上辣根过氧化物酶，在ＥＬＩSＡ板上与血清中Ｎ－糖苷键型糖蛋白反应，按常规方法显色。以正常人血清与肺癌蛋白提取物反应，在４９０ｎｍ的吸光度平均值加两个标准差作为阳性阈值。肺癌病人血清的阳性率４３．３％（２６／６０），非癌性肺病为１５．０％（６／４０），健康对照组为１０．０％（４／４０），肺癌病人血清的阳性率与病理类型无相关性。结果提示，肺癌病人血清中Ｎ－糖苷键型糖蛋白能较特异地与肺癌组织提取蛋白相结合。

链霉蛋白酶P、糖苷酶对低分子量肝细胞生长素生物活性的影响

目的研究链霉蛋白酶P、糖苷酶对低分子量肝细胞生长素生物活性的影响。方法用链霉蛋白酶P、N-糖苷酶F、O-糖苷酶分别对低分子量肝细胞生长素消化,观察消化后低分子量肝细胞生长素以及未经消化的低分子量肝细胞生长素和促肝细胞生长素对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞的增殖作用,用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法测定这些细胞的增殖情况。结果低分子量肝细胞生长素与促肝细胞生长素对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞均有明显增殖作用(P<0.01);低分子量肝细胞生长素与促肝细胞生长素均对人肝癌细胞株QGY增殖作用最明显(P<0.01);低分子量肝细胞生长素增殖作用较促肝细胞生长素明显(P<0.01)。低分子量肝细胞生长素经链霉蛋白酶P、O-糖苷酶消化前后对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞增殖作用无影响(P>0.05);低分子量肝细胞生长素经N-糖苷酶F消化后对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞增殖作用明显减弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论低分子量肝细胞生长素促进人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞增殖作用比促肝细胞生长素更显著。