鹅颈藤壶多糖提取、理化性质及N-糖链表达谱分析研究

本文以南海海域鹅颈藤壶(Lepas anatifera)为原料,提取鹅颈藤壶背甲与肌肉质柄中的多糖,基于其基本理化性质的分析,比较不同生长时期鹅颈藤壶N-糖链表达谱的差异性。经过脱脂、碱水解/蛋白酶解、乙醇沉淀方法提取得到粗多糖;利用高效液相色谱法、高效凝胶渗透色谱法、苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法对其单糖组成、分子量分布、总糖含量及蛋白质含量进行分析;采用液质分析(PGC-ESI-MS/MS)方法对鹅颈藤壶成体(A-GB)与幼体(L-GB)肌肉质柄中N-糖链进行分析并比较。表明肌肉质柄中多糖分子量为18.40 kDa;总糖含量为11.99%,蛋白质含量60.14%,富含甘露糖、葡萄糖、氨基半乳糖,其中甘露糖的含量高达80%以上。在鹅颈藤壶成体与幼体中均鉴定得到26条N-糖链,成体中高甘露糖型N-糖链占总糖链的20.81%,且相对丰度较高的糖型组成为F_(1)H_(3)N_(2)(39.06%)、F_(1)H_(3)N_(3)(24.44%)、H_(3)N_(3)(9.35%);幼体中高甘露糖型N-糖链占总糖链的52.17%,相对丰度较高的糖型组成为F_(1)H_(3)N_(2)(21.65%)、H_(6)N_(2)(15.93%)、H_(5)N_(2)(14.75%)。鹅颈藤壶多糖是一类N-糖基化的蛋白复合物,推测N-糖链在鹅颈藤壶长发育过程中发挥着至关重要的作用,可能高甘露糖型N-糖链与其附着黏附能力密切相关。

糖蛋白过敏原N-糖链与过敏的相关性研究

糖蛋白是一种含有寡糖链的蛋白质,糖链与蛋白质之间以共价键相连。N-糖蛋白为常见过敏原之一,主要来源于食物、吸入物、昆虫毒素等,能够引起过敏反应。N-糖蛋白过敏原的N-糖链结构影响过敏原与IgE的结合,影响抗原提呈细胞(APC)对过敏原的识别和提呈。本文在介绍与过敏相关的N-糖蛋白、常见N-糖蛋白过敏原的N-糖链结构及与过敏相关的糖基化酶的基础上,进一步分析过敏原N-糖链影响过敏的机制,为临床预防与治疗过敏性疾病提供新的思路。

基于电喷雾电离质谱的人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的N-糖链的定性定量比较

以培养的原发性肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02为研究对象,采用细胞裂解液提取总蛋白,用PNGase F酶解释放N-糖链,以微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化分离N-糖链,通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对N-糖链进行序列鉴定,以β-环糊精为内标对2种细胞系的N-糖链进行了定量比较分析.结果表明,在肝癌细胞系HepG2和正常细胞系L02中共检测到26种N-糖链,与L02相比,HepG2的大多数高甘露糖型糖链、唾液酸化糖链和岩藻糖基化糖链的数量都明显升高,其中有15种糖链在数量上具有极显著性差异(p<0.01),1种糖链具有显著性差异(p<0.05).本研究为进一步探索肝癌中各类N-糖链的表达特点及发现早期肝癌糖链标志物提供了参考.

基于MALDI-TOF质谱技术分析人宫颈癌HeLa细胞N-糖链结构轮廓

以微量HeLa细胞(107个)为对象,经细胞裂解、还原羧甲基化、胰酶降解和Oasis-HLB柱提取分离得到总糖肽后,用PNGase F酶解释放N-糖链.对所得N-糖链用Sep-Pak C18柱纯化后进行完全甲基化衍生,再采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析HeLa细胞表面N-糖链的结构轮廓.结果表明,在获得的34种N-糖链中,除高甘露糖型、二天线、三天线、四天线和五天线等N-糖链外,还出现了在某种程度上与肿瘤发生转移相关的特殊平分型和Lewis结构.利用MALDI-TOF MS技术可快速分析微量癌细胞表面N-糖链的结构轮廓,为进一步寻找肿瘤糖链标志物及肿瘤的早期预防诊断提供技术支持.

微量生物样品中糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立

基于电喷雾电离质谱检测技术,建立了一种可靠、高效、简单,适合于微量糖蛋白N-糖链解离、富集纯化的方法。以糖蛋白牛胰核糖核酸酶(Rib B)和卵清白蛋白(OVA)为模型蛋白直接酶解,比较了4种方法纯化酶解样品的效果。比较了直接酶解和经过聚偏氟乙烯(PVDF)膜富集后酶解微量复杂生物来源样品胎牛血清的酶解效果,最终建立了微量生物样品中糖蛋白N-糖链的质谱分析前处理方法。采用PVDF膜吸附复杂生物样品中的糖蛋白,N-糖苷酶F(PNGase F)酶直接在膜上完成糖链释放(37℃,24 h),采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化,用于微克级胎牛血清和健康人血清中N-糖链质谱分析的前处理。本方法通用性好,在微量生物样品糖链质谱分析检测的前处理方面具有一定应用价值。

N-糖链合成抑制剂对NIH3T3细胞粘附作用和整合蛋白表达的影响

研究了Ｎ－糖链合成抑制剂——Ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＭＭ）和衣霉素（ＴＭ）对ＮＩＨ３Ｔ３细胞粘附作用和细胞表面α５β１整合蛋白含量的影响．研究结果发现甘露糖苷酶Ⅰ抑制剂－ＤＭＭ处理ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，３Ｈ－甘露糖（３Ｈ－Ｍａｎ）参入ＮＩＨ３Ｔ３细胞较对照细胞增加一倍，多天线复杂型糖链增加１８％，而细胞表面α５β１整合蛋白与纤连蛋白粘附能力却下降１７％，但对膜整合蛋白α５和β１亚基表达量无明显影响，提示不成熟的糖链对整合蛋白参与的细胞粘附功能有一定影响，但不影响糖蛋白运输及整合到膜上．十四糖二磷酸长萜醇合成抑制剂——ＴＭ为０．５μｇ／ｍｌ时，Ｎ－糖链合成显著抑制，３Ｈ－Ｍａｎ参入减少了５２％，细胞粘附能力下降了３７％，细胞表面膜整合蛋白α５亚基下降了２２％，而β１亚基无明显变化，提示ＴＭ的脱糖基化作用可引起α５亚基转运至细胞膜表面下降，以至影响了细胞的粘附能力．此外，脱糖整合蛋白与纤连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｆｎ）的结合力下降也是原因之一．

新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料的合成及其在蛋白质N-糖链富集中的应用

蛋白质的N-糖基化修饰与多种重要的生理、病理进程密切相关,是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。由于糖蛋白本身多是低丰度表达的蛋白质,且糖链结构具有高度微不均一性,这使得蛋白质糖基化修饰的分析具有一定的挑战。本研究利用表面引发-原子转移自由基聚合(SI-ATRP)法,以带有双键的氨基葡萄糖为单体(GMAG),成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料(pGMAG-SiO2)。由于在硅胶表面引入致密的亲水聚合物层,该填料不仅保持了硅胶良好的机械强度,而且显著提高了其亲水性,因此非常适合作为亲水填料用于蛋白质的N-糖链富集。以麦芽七糖和鸡卵清蛋白的N-糖链为研究对象,考察了该填料对N-糖链的富集效果,并将该杂化填料成功用于人血浆中糖蛋白N-糖链的富集检测,共鉴定了47种糖型。以上结果表明,pGMAG-SiO2填料对N-糖链具有较高的亲和性,可以用于N-糖链的高覆盖率鉴定。

肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体N-糖链结构与功能的变化

探讨肝癌细胞与正常肝细胞 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR)N 糖链结构与功能的差异 .采用流式细胞术检测SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞膜表面 6 7LR的表达 ,并分别从这 2株细胞分离纯化到高亲和力的 6 7LR ,利用凝集素结合分析其糖链结构 ,并用肽 N 糖苷酶水解N 糖链 ,观察糖链在与层粘连蛋白结合过程中的作用 .结果发现 ,L 0 2细胞膜表面 6 7LR表达的阳性率为5 5 3% ,而SMMC 772 1细胞为 34.7% ,这两株细胞 6 7LR与伴刀豆素 (ConA)的结合能力无显著差异 ,但SMMC 772 1细胞的 6 7LR与麦胚凝集素的结合能力明显高于L 0 2细胞的 6 7LR ,说明 2株细胞 6 7LR的糖链结构存在显著差异 .当N 糖链被切除后 ,SMMC 772 1细胞的 6 7LR与层粘连蛋白的结合能力明显下降 ,而L 0 2细胞则没有变化 .这些资料表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白结合能力的差别 ,以及两株细胞的 6 7LR与层粘连蛋白结合能力的不同 ,很可能是由于这两株细胞的层粘连蛋白受体的N

N-糖链抑制剂对高糖刺激鼠肾系膜细胞粘着斑激酶表达及透明质酸分泌的影响

目的 :观察N 糖链抑制剂衣霉素 (TM)和 1 deoxymannojirimycin (DMM)对高糖刺激肾小球系膜细胞(GMC)增生、粘着斑激酶 (FAK)表达及透明质酸 (HA)分泌的影响。 方法 :体外培养大鼠GMC ,分为七组 :正常组 ,高糖组 ,甘露醇组 ,高糖加衣霉素组 ,高糖加DMM组 ,并设TM、DMM对照组。采用四唑盐比色 (MTT)法测定细胞增生 ,免疫组织化学方法测定粘着斑激酶 (FAK) ,放射免疫法测定透明质酸 (HA)含量。 结果 :高糖可诱导GMC增生、增加FAK表达及HA分泌。相对于正常培养条件下生长的GMC ,N 糖链抑制剂TM和DMM对高糖作用条件下的GMC增生、FAK活性及HA分泌有更为明显的抑制作用。 结论 :N 糖链抑制剂TM和DMM可通过阻断糖链的合成和改变糖链类型抑制高糖诱导的细胞增生、FAK活性及HA分泌的作用。

肾小球系膜细胞中Β_1整合素表达及细胞凋亡与N-糖链抑制剂关系的研究

目的观察N-糖链抑制剂衣霉素(TM)对肾小球系膜细胞(GMC)增殖、凋亡的影响以及Β1整合素和CYCLIN D1表达在细胞凋亡以及细胞增殖中的作用。方法体外培养的大鼠GMC分四组:正常对照组,0.5、1.0和2.0ΜG/ML衣霉素组。采用流式细胞技术测定Β1整合素水平和细胞凋亡率,细胞免疫化学方法测定CYCLIN D1表达,MTT法测定细胞增殖能力。结果TM作用以后,细胞Β1整合素水平降低,细胞凋亡率增加,同时细胞周期正调控蛋白CYCLIN D1表达下降,增殖能力降低,这种作用呈剂量依赖性。结论N-糖链抑制剂TM通过抑制Β1整合素的表达,影响细胞的粘附而导致细胞凋亡,并影响细胞周期正调控蛋白CYCLIN D1表达,使细胞增殖能力受抑,这种作用呈剂量依赖性。

骨髓基质细胞中MGAT3催化的平分型N-糖链对血液细胞黏附和迁移的影响

骨髓基质细胞是造血微环境的重要组成之一,在促进造血干细胞生成血细胞的各个环节中起着十分重要的作用。研究了人骨髓基质细胞HS5中抑制平分型N-糖链的表达,并观察其对共培养体系中血液细胞黏附和迁移的影响。利用基因工程技术在HS5中沉默平分型N-糖链合成中的关键酶,即N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(MGAT3),用凝集素染色检测发现沉默MGAT3后HS5中平分型N-糖链的表达量降低。通过共培养发现,HS5中的平分型N-糖链降低后,血液细胞KG1a和PL-21对HS5的黏附能力降低,迁移能力也随之降低。由此表明,平分型N-糖链参与的骨髓造血微环境对调控血液细胞黏附和迁移方面有重要的生物学功能。

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

N-糖链参与细胞凋亡的研究进展

N 糖基化蛋白质的寡聚糖链 (简称N 糖链 )在参与细胞与细胞的粘附、识别以及蛋白受体调节的细胞表面蛋白中发挥着重要作用 ,干扰N 糖链生成途径中寡聚糖转移酶和磷酸多萜醇的结构和功能或完全阻断N

肝型碱性磷酸酶N-糖链亲和层析用于原发性肝癌诊断研究

目的研究肝型碱性磷酸酶Ｎ－糖链亲和层析在原发性肝癌诊断中的应用价值。方法用麦胚凝集素ＷＧＡ分离血清中肝型碱性磷酸酶和骨型碱性磷酸酶，再将肝型碱性磷酸酶进行蔓陀萝凝集素ＤＳＡ亲和层析，分离不同亲和力组分，测定酶活力；将血清直接上样ＤＳＡ亲和层析柱，分离肝型碱性磷酸酶强结合组分。结果正常成人血清肝型碱性磷酸酶不与ＤＳＡ结合，而慢性乙型肝炎、肝硬化出现了ＤＳＡ弱结合组分且随肝病慢性化发展有增加之趋势。在原发性肝癌肝型碱性磷酸酶中分离到ＤＳＡ强结合组分，且在所检１８例原发性肝癌中均存在，但在正常人血清及慢性肝病血清中未发现。用肝型碱性磷酸酶ＤＳＡ强结合组分诊断原发性肝癌的灵敏度和特异度均可高达１００％。结论肝型碱性磷酸酶强结合组分为原发性肝癌特异性标志，血清肝型碱性磷酸酶ＤＳＡ亲和层析是一种诊断原发性肝癌的灵敏可靠的方法。

N-糖链合成相关β-1,4半乳糖基转移酶在人星形胶质细胞瘤中的表达

目的分析与N-糖链合成相关β-1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ(β1,4-galactosyltransferaseⅠ、Ⅱ、Ⅴ,β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ)mRNA在正常脑组织和各级人星形胶质细胞瘤的表达变化。方法采用RT-PCR方法,分析β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人星形胶质细胞瘤的表达存在。以扩增的3种同工酶cDNA片段作为探针进行标记,Northernblot分析其mRNA在正常脑组织和各级人星形胶质细胞瘤中的表达变化。结果RT-PCR检测到β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人星形胶质细胞瘤中的表达存在。northernblot发现β-1,4-GalT-Ⅱ、Ⅴ在正常脑组织中有表达,但β-1,4-GalT-Ⅱ的表达较低,而β-1,4-GalT-Ⅰ在正常脑组织中表达极低。β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在星形胶质细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织。其中,β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ在各级胶质瘤中的表达没有明显差异。而β-1,4-GalT-Ⅴ的表达随胶质瘤分级的增高而增加。结论N-糖链合成相关的β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人脑星形胶质细胞瘤发生过程中的表达不同,尤其是β-1,4-GalT-Ⅴ的表达与人星型胶质瘤的恶性程度显著相关。

人皮肤成纤维细胞纤连蛋白的纯化及其N-糖链结构

研究人皮肤成纤维细胞纤连蛋白及其片段 Ｎ－糖链结构。用明胶－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和柱纯化培养的人皮肤成纤维细胞所分泌的纤连蛋白（Ｆｎ），用胰糜蛋白酶限制性水解，获得明胶结合片段和肝素结合片段；用肼化的凝集素与经过碘酸氧化后的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）缩合的方法制备 ４种 ＨＲＰ－凝集素（Ｃｏｎ Ａ， ＤＳＡ，ＷＧＡ，ＬＣＡ）探针，用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法检测明胶结合片段（Ｍｒ４３ × １０３）、肝素结合片段（Ｍｒ３０ ×１０３，２５ ×ｌ０３）在切除唾液酸及平分型 Ｎ－乙酰氨基葡萄糖（ＧＩｃＮＡｃ）前后的 Ｎ－糖链结构。结果： Ｆｎ的 Ｎ－糖链主要存在于 Ｍｒ分别为４３ × １０３、３０ ×１０３、２５ ×１０３的３个片段上，其结构为二、三（主要是Ｃ２Ｃ２６）或四天线的复杂型糖链；糖链末端连有唾液酸（ＳＡ）；都含有核心岩藻糖（ｃ－Ｆｕｃ；平分型 ＧｌｃＮＡｃ只存在于 ４３ × １０３片段所连的糖链中，而且很可能与 Ｃ—Ｆｕｃ共同存在于二天线或Ｃ２Ｃ２６三天线精链上；Ｆｎ的糖链中不含有Ｎ－乙酰乳糖胺重复顺序。结论：在Ｆｎ不同片段上均含有复杂型Ｎ糖链，并存在核心岩藻糖结构，平分型ＧｌｃＮＡｃ只存在于４３ ×１０３片段上。

不同肿瘤细胞诱导分化时表面N-糖链结构变化的比较研究

目的 为比较不同肿瘤细胞株诱导分化时表面N-糖链结构的变化。方法 采用 Con A和 DSA凝集素亲和柱层析法分析 SMMC 772 1人肝癌细胞受 ATRA和 db-c AMP以及 HL - 6 0人早幼粒白血病细胞受 ATRA和 PMA诱导分化时细胞表面糖蛋白上 N-糖链的结构变化。结果 ATRA和 db- c AMP均使 SMMC 772 1细胞表面高甘露糖型/杂合型和三 /四天线复杂型 N-糖链减少而二天线复杂型N-糖链增多。ATRA和 PMA也均使 HL- 6 0细胞表面三 /四天线 N-糖链减少和二天线 N-糖链增加 ,但却使高甘露糖型/杂合型 N-糖链增加。结论 同一细胞受不同诱导剂分化时 ,其表面 N-糖链的结构有相同的变化 ,也有不同的变化 ;

人血浆N-糖链超高效液相色谱检测方法的优化

优化了超高效液相色谱(UPLC)检测N-糖链的方法,并用于人血浆样品检测。人血浆样品直接加热后使用N-糖酰胺酶F消化释放糖链,N-糖链经2-氨基苯甲酸胺(2-AB)标记反应4h,采用60%的乙腈进样浓度进行色谱分离,共得到19个色谱峰,对各峰使用离线基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测得到N-糖链结构40种,其中含具有末端唾液酸修饰的N-糖链27种。结合液相色谱、唾液酸酶消化和质谱结构分析发现:部分N-糖链末端唾液酸无论是在三氯乙酸(TCA)沉淀还是氯仿/甲醇沉淀的前处理过程中都发生了解离;80%的乙腈进样浓度会导致大部分含唾液酸N-糖链沉淀而影响色谱检测;而2-AB标记4h反应时间能够在提高检测灵敏度的同时减少唾液酸的损失。使用该方法仅需2.5μL血浆样品即可进行检测,日内和日间的重复性试验结果均无显著性差异。研究结果表明优化后的UPLC法适用于富含唾液酸的人血浆样品的检测。

纤连蛋白受体分子中N-糖链对其与纤连蛋白结合的影响

研究纤连蛋白受体（FnR）分子中N-糖链对其与纤连蛋白（Fn）结合的影响。利用纤连蛋白片断亲和层析柱和麦胚凝集素亲和层析柱，从人胎盘组织中纯化得到了FnR，经SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳证实为α和β两个亚基所组成。制备嵌合FnR的脂质体后，用糖甘酶处理以获得合不同糖链结构FnR脂质体，研究FnR分子中糖链在受体与配体结合中的作用。结果：用唾液酸酶处理嵌合FnR的脂质体，与Fn的粘附能力保持不变。嵌合FnR的脂质体单用p-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶处理，或用唾液酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，β-半乳糖苷酶三者联合处理，其与Fn的粘附能力均下降50％。结论：FnR上糖链改变确实能影响FnR与Fn的结合，但FnR糖链上末端的唾液酸可能不影响两者的结合，而FnR糖链上末端或平分型N-乙酸氨基葡萄糖（GlcNAc）在两者结合时可能起重要作用。

β-伴大豆球蛋白的N-糖基化位点及其N-糖链的质谱分析

以β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)为研究对象,利用Trypsin和Pepsin酶对其进行水解,以Con A亲和层析柱富集纯化糖肽,并用糖苷酶PNGase F和Endo H分别酶解糖肽,再采用电喷雾质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对所得肽段的氨基酸序列及糖链的结构进行了分析,最后通过数据库检索对分析结果进行验证.结果表明,β-conglycinin具有5个N-糖基化位点,分别为α亚基的199和455位天冬酰胺(Asn),α'亚基的215和489位Asn及β亚基的326位Asn,且每个糖基化位点均被H5N2,H6N2,H7N2和H8N2这4种高甘露糖型N-糖链所修饰.本研究为各种糖蛋白的糖基化位点及其对应的糖链结构的鉴定分析提供了方法参考,并为深入理解大豆糖蛋白抗原表位的特异性及致敏机理提供了依据.