N-脱氧核糖转移酶Ⅱ催化合成克拉屈滨及其定向进化

目的:使用表达N-脱氧核糖转移酶Ⅱ (Nucleoside deoxyribose transferase, NDT)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-NDT,作为催化剂,合成克拉屈滨(Cladribine)。同时构建高通量的酶活筛选体系,利用其改造NDT,以期提高克拉屈滨的合成效率。方法:首先用野生型NDT催化克拉屈滨的合成。接着以黄嘌呤氧化酶和辣根过氧化物酶联合作用来检测NDT酶活。最后构建NDT随机突变体库,并筛选出突变体。结果:在10%DMSO的体系中,野生型NDT催化2-氯腺嘌呤合成克拉屈滨的转化率达到93%。同时使用构建的筛选体系在突变体库中筛选到了酶活发生改变的突变体。结论:本研究使用NDT作为催化剂,成功地一步合成了克拉屈滨。同时本研究构建的高通量筛选方法成功应用于改造NDT的酶学性质,为拓展NDT合成核苷类似物的能力提供了一种新的方法。

自诱导系统在酶促合成2’-脱氧胞苷中的应用

旨在高效合成2’-脱氧胞苷(d Cyd)。DCyd作为一类重要的药物中间体,能够用于合成吉西他滨(d Fd C)、扎西他滨(dd C)等多种抗病毒或抗肿瘤的药物。采用ZYM-Fe-5052自诱导培养基对含有N-脱氧核糖转移酶II(NDT)的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,所得完整菌体直接用于催化合成d Cyd。结果表明,自诱导系统不仅无需额外添加诱导剂,还能够达到较高的菌体密度,且与LB诱导系统所得菌体在合成d Cyd方面具有同样高效的催化活性。2’-脱氧胸苷(d Thd)和胞嘧啶的浓度比为1∶3时,产物转化率可高达86.5%。合成d Cyd的最适反应条件为:2’-脱氧胸苷(d Thd)和胞嘧啶的浓度比为1∶1.5,p H6.5的磷酸缓冲液,1 mg/m L的菌体量,终体系10 m L,30℃条件下反应1 h,产物转化率可达71.9%。此方法还可用于制备其他核苷类似物,具有广泛的适用性和应用前景。

酶法合成5-杂氮-2’-脱氧胞苷

将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的N-脱氧核糖转移酶II的基因(ntd)克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建原核表达系统,成功地得到一株大量表达N-脱氧核糖转移酶II的菌株PND。以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,该重组菌可大量表达N-脱氧核糖转移酶II。在此酶作用下,以5-杂氮胞嘧啶和脱氧胸苷为底物,生成胸腺嘧啶和目标产物5-杂氮-2’-脱氧胞苷。最佳反应条件为:底物浓度均为2 mmol/L,20 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH为7.1),200μL酶,最终反应体积2 mL,55℃反应2 h,转化率可达61%。

酶法合成6-氯嘌呤核苷

利用菌种Lactobacillus helveticus（ATCC 10697）所产生的N-脱氧核糖转移酶,以底物鸟苷和6-氯嘌呤为原料通过碱基交换合成6-氯嘌呤核苷,并优化了反应条件,25 m1的锥形瓶装有反应液10 ml,结果显示最佳反应条件如下：底物最适反应浓度为30 mmol/L（鸟苷）和10 mmol/L（6-氯嘌呤）,菌体添加量8%～10%（湿重）,反应温度40℃,0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值6.0）,摇床转速120 r/min,反应时间24 h,6-氯嘌呤核苷收率可达到51.6%,具有较好的应用前景.