群体感应淬灭酶PF-1240的半理性设计及其对蜂房哈夫尼亚菌群体感应的抑制

群体感应(QS)是细菌通过N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)等信号分子相互交流的过程。通过群体感应淬灭(QQ)酶体外降解AHLs,是抑制腐败菌致腐因子产生的一种有效手段。为进一步提升QQ酶PF-1240的活性和实用性,通过同源建模手段构建酶PF-1240的三维预测模型,并将其与不同的AHLs进行分子对接。以此为基础,利用虚拟突变手段对影响酶活性的关键位点进行筛选并鉴定出Asn418为最佳突变位点,进而对突变体进行表达,分析其酶学性质和QS抑制效果。结果表明:突变酶对短链AHLs有较强的淬灭能力,其最适pH值变为7,最适温度由30℃变为20℃。此外,突变酶有效降低了蜂房哈夫尼亚菌的群集和泳动能力,当其质量浓度为15μg/mL时,生物膜的抑制率为41.93%,抑制效果远好于野生酶。本研究表明Asn418是影响PF-1240酶学性质及酶活性的关键氨基酸,为酶PF-1240的理性设计及在水产品保鲜领域应用提供了理论依据。

假单胞菌WX14群体感应淬灭酶基因的克隆及其功能研究

本研究采用报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定并筛选到10株具有较强降解酰基高丝氨酸内酯(AHLs)能力的细菌,其中菌株WX14降解AHLs能力较强,且菌体和菌体外泌物均具有降解活性。利用PCR法从菌株WX14中克隆到hac A和hac B两个群体感应淬灭酶基因,基因全长分别为2286和2370 bp,氨基酸序列比对分析结果表明,Hac A属于阿库来菌素A酰化酶蛋白家族,Hac B属于青霉素G酰化酶蛋白家族。这两个基因编码产物均为N末端亲核(N-terminal nucleophile,Ntn)水解酶家族成员。将hac A和hac B导入到软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum后,可减弱该细菌在马铃薯块和白菜上的致病性,因此这2种AHLs降解酶对依赖于群体感应的软腐病有一定防病作用。经16S rDNA序列同源性分析鉴定,3株为假节杆菌Pseudarthrobacter spp.、1株节杆菌Paenarthrobacter sp.、4株假单胞菌Pseudomonas和2株芽胞杆菌Bacillus spp.。

大菱鲆源荧光假单胞菌群体感应淬灭酶基因的克隆及生物信息学分析

导致水产品腐败变质的微生物之间存在一种信息交流机制,称之为群体感应。革兰氏阴性细菌群体感应系统主要由N-酰基高丝氨酸内酯作为信号分子,在水产品中间接调控一些腐败菌的致腐特性。可通过淬灭群体感应来抑制水产品的腐败。作为群体感应抑制剂的群体感应淬灭酶在许多细菌中被鉴定出来。为探究荧光假单胞菌PF08的pf-1240基因表达产物的潜在功能,通过基因克隆和生物信息学分析对其进行研究。结果表明:荧光假单胞菌PF08的pf-1240基因能编码一种群体感应淬灭酶,与铜绿假单胞菌PAO1的第2个高丝氨酸内酯酰化酶QuiP蛋白的相似性为65.82%。序列分析显示:pf-1240基因共编码795个氨基酸,蛋白分子式为C_(3867)H_(6010)N_(1084)O_(1160)S_(19),相对分子质量86855.96,理论等电点为7.81,不稳定系数为35.29,属于亲水蛋白。由保守结构域分析可知,该蛋白包含一个完整的青霉素酰化酶家族结构域且该家族中有许多酶被证实具有群体感应淬灭酶功能,能够分解长链群体感应信号分子AHLs。推测该蛋白也具有类似的群体感应淬灭酶功能。本研究借助生物信息学技术对其理化性质、结构等情况进行预测分析,以便深入了解荧光假单胞菌群体感应淬灭酶的性质和功能。