白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因的原核表达及鉴定

目的 对白纹伊蚊细胞色素P4 5 0CYP6N3基因进行原核表达 ,以获得高效表达蛋白。方法 根据CYP6N3基因的全长cRNA为模板进行RT -PCR。产物经T -A克隆测序鉴定后 ,亚克隆入原核融合表达载体 pGEX - 4T - 1(含有编码 2 6KDaGST的基因序列 )中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,通过Westernblot分析鉴定目的蛋白的位置 ,并运用核酸蛋白分析仪扫描凝胶以确定表达产物的含量。结果 获得了高效表达的融合蛋白GST -CYP6N3,表达量占菌体总蛋白的 37 4 9%。结论 本实验成功地异源表达了白纹伊蚊CYP6N3基因 ,为体外重建细胞色素P4 5 0CYP6N3单加氧酶系 。

2018—2022年无锡市H3N2流感病毒全基因组特征分析

目的了解无锡市近年H3N2流感病毒的进化和变异特征。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法,对流感样病例标本进行检测和分型,将H3N2流感病毒核酸阳性标本经细胞培养后,选取红细胞凝集试验(HA)≥1∶8的毒株扩增全基因组,构建文库,采用MiSeq测序仪上机测序,以NC_007366.1为参考株,使用CLC Genomics Workbench(Version 23)软件分析,采用MEGA 7.0软件构建系统进化树,NetNGlyc 1.0 Server软件预测N-糖基化位点。结果2018—2022年共监测流感样鼻咽拭子标本10440份,流感病毒核酸阳性率9.60%,H3N2型占28.44%(285株)。对19株H3N2型毒株进行全基因组测序分析,以HA基因核苷酸、氨基酸同源性最低,分别为97.43%~100.00%、96.37%~100.00%;M基因核苷酸、氨基酸同源性最高,分别为98.23%~100.00%、100.00%。不同基因核苷酸、氨基酸变异率差异均有统计学意义(χ^(2)=41.26、86.12,P值均<0.05),核苷酸变异率3.05%(M)~7.05%(HA),氨基酸变异率1.54%(PB2)~7.45%(NA)。基因进化距离以NS最小(0.000~0.028)、HA最大(0.000~0.065)。H3N2流感流行株2018流感监测年(1—3月)属3C.2a进化分支,2018—2020流感监测年属3C.2a1b.2进化分支,2022流感监测年(4—12月)属3C.2a1b.2a.1a.1进化分支。19株H3N2型毒株8个基因片段均有突变位点,以HA(51个)和NA基因(40个)较多,M基因较少(6个);5年均有特有突变位点,HA基因存在9~12个潜在N-糖基化位点,NA基因均为6个潜在N-糖基化位点。结论无锡地区H3N2流行株虽在不断进化,与疫苗株匹配性仍较好。应进一步加强监测,及时掌握流感病毒流行趋势,以制定有效的防控策略。

Sanger法测定季节性H3N2亚型流感病毒全基因组序列

目的对流行的季节性甲型H3N2亚型流感病毒进行全基因组测序。方法本文对甲型H3N2亚型流感病毒测序过程中的PCR扩增引物进行优化及精简，同时对PCR产物纯化方法进行了改进。使用优化后的34对PCR引物和优化后的纯化方法，对194株甲型H3N2亚型病毒进行了测序。结果利用优化后的测序方法，可保证获得甲型H3N2亚型流感病毒的8个片段全基因组序列，而且大大缩短了实验时间，节约了实验成本和人力。结论我们应大力开展A（H3N2）亚型流感病毒的序列测定工作，及时发现病毒变异情况，以推选出与人群中的流行株更为匹配的疫苗株。

2022-2023年无锡市甲型H3N2流感病毒全基因组特征分析

目的了解无锡市2022-2023年甲型H3N2流感病毒的全基因组和遗传进化特征。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法对流感样病例呼吸道样本进行分型检测,对甲型H3N2流感病毒核酸阳性的样本进行病毒分离培养,红细胞凝集试验(HA)≥1∶8的毒株提取核酸,扩增全基因组序列,构建文库,采用MiSeq测序仪上机测序。以NC_007366.1为参考株,使用CLC Genomics Workbench(Version 23)软件分析下机数据。采用MEGA 7.0软件构建系统进化树,NetNGlyc 1.0 Server软件预测N-糖基化位点。结果2022-2023年35株甲型H3N2流感病毒流行株之间的核苷酸同源性为96.4%-100%,氨基酸同源性为95.2%~100%。2022年16株流行株属于3C.2a1b.2a.1a进化分支,2023年19株流行株属于3C.2a1b.2a.2a.3a.1进化分支。2022年流行株与对应疫苗株比较HA基因核苷酸序列存在7个差异位点,共享15个突变位点;2023年流行株与对应疫苗株比较HA基因核苷酸序列存在28个差异位点,共享17个突变位点。35株流行株HA基因均缺少N-糖基化位点61:NSS,而2023年19株流行株HA基因新增N-糖基化位点110:NSS。结论2022年和2023年甲型H3N2流感病毒的HA和NA基因分别属于2个进化分支,与相应疫苗株比较均出现特异性氨基酸位点改变。2022年流行株与疫苗株比较抗原匹配性较好,2023年流行株与疫苗株比较存在抗原匹配性较低的现象。

2014—2015年北京市房山区H3N2亚型流感病毒基因特性

目的了解北京市房山区2014—2015年H3N2亚型流感病毒HA1基因变异情况。方法随机分别选择2014—2015年流感病原学监测中分离到的H3N2型毒株共26株,采用RT-PCR法扩增病毒目的基因片段后进行序列测定,与WHO推荐的北半球疫苗株及常见H3N2毒株进行比对并构建进化树。采用MEGA6软件对测序结果进行分析,同源性计算使用BLAST网站,利用NetNGlyc 1.0软件进行糖基化位点预测。结果 2014—2015年房山区H3N2亚型流感病毒HA1目的基因片段序列测定拼接后最长核苷酸片段为703 bp最短核苷酸片段为696 bp,没有核苷酸的丢失,编码氨基酸为232-234个;抗原表位A抗原表位和D抗原表位有变异;受体结合位点第228位由丙氨酸变为丝氨酸,第130位由丝氨酸变为苏氨酸;做进化树分析,发现该分析中的H3N2亚型流感病毒位于2个分支上,分别为A/Switzerland/9 715 293/2013和A/HongKong/5 738/2014,大部分与前者在一个分支。结论北京市房山区2014—2015年H3N2流感病毒的血凝素重链区HA1基因特性有部分变化,抗原表位A抗原表位和D抗原表位有变异,且在基因进化上与当年的疫苗株分属不同分支,具有一定的进化距离,相似度较低,可能导致H3N2流行。

青少年甲型H3N2流感相关脑膜脑炎1例

流感相关脑病/脑炎是一种由流感病毒引起的严重神经系统并发症, 在青少年及成人中少见。该疾病诊断需要基于流行病学、临床表现和神经影像学综合分析。因为临床表现和神经影像学差异大, 并且在脑脊液及脑组织中很少检测到流感病毒, 因此该疾病诊断较困难。本文报道1例以"反复发热伴头痛"为主诉的青少年甲型H3N2流感相关病毒性脑膜脑炎病例。该患者病毒抗原及核酸检测均为阴性, 最后在脑脊液中通过靶向宏基因组测序技术明确病原体为甲型H3N2流感病毒。

一种利用RT-PCR特异扩增甲型流感病毒HA基因多变区片段并测序确定分型的方法

针对甲型流感病毒HA基因的H1,H2,H3,H5,H7和H9亚型的序列特征,设计专用PCR引物,通过RT-PCR特异扩增相应片段并测定序列,可以准确地区分H1和H3感染人类的流感病毒及其亚型.这种基于流感病毒核酸序列测定的特异性检测方法,不仅可以用于新型甲型H1N1病毒的快速确诊和分型,并且还可推广应用于今后其他流感病毒或具有爆发潜力的新型流感病毒的监测.

常染色体显性遗传脑动脉病(附1例报告及文献复习)

目的报道常染色体显性遗传脑动脉病(CADASIL)病例,加深对CADASIL的认识。方法报道1例以偏头痛为首发症状、皮质下梗死和白质脑病为主要临床表现的CADASIL病例,回顾性分析患者的临床和影像学资料、对患者及其女儿行NOTCH3基因、H77M1基因突变热区基因测序和家系调查结果,并结合文献复习进行讨论。结果患者女性,59岁。因头痛34年,认知功能障碍11年加重,伴意识障碍2 h入院。头颅CT、MRI示左侧额颛叶数个急性期腔隙性梗死灶,双侧小脑半球、脑干、双侧大脑半球多发对称性异常信号,考虑脑白质病,血管性病变所致?基因测序提示N0TCH3基因第4、18外显子突变、H77141基因第8外显子突变。结论偏头痛为CADASIL的常见首发临床表现,N0TCH3基因突变是中国CADASIL患者的主要突变基因,临床应结合病程及家族发病情况综合考虑,基因检测可协助明确诊断。