珠芽艾麻中黄酮及其抗N1神经氨酸酶的活性

目的研究荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻的化学成分,以期得到具有抑制N1神经氨酸酶活性的化合物。方法采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等方法进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据分析鉴定化合物的结构。结果从荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻分离得到了13个黄酮类化合物,分别鉴定为:金合欢素-7-O-芸香糖苷(acaetin-7-O-rutinoside,1)、木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside,2)、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside,3)、芹菜素(apigenin,4)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside,5)、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷(kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside,6)、金丝桃苷(hyperoside,7)、槲皮素-7-O-β-D-6″-乙酰葡萄糖苷(quercetin-7-O-β-D-6″-acetylglucopyranoside,8)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside,9)、大豆素(daidzein,10)、大豆苷(daidzin,11)、染料木苷(kaemferitrin,12)、红车轴草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(pratensein-7-O-β-D-glucopyranoside,13)。对化合物1-13的抑制N1神经氨酸酶活性进行了测定,结果显示化合物5、6、9具有较强的活性。结论化合物10-13为异黄酮类化合物,该类化合物为首次从荨麻科中分离得到。化合物1-13均为首次从珠芽艾麻中分离得到。其中化合物5、6、9抑制N1神经氨酸酶活性较强。

基于分子对接技术筛选中草药中潜在的H1N1病毒神经氨酸酶抑制剂

甲型H1N1流感病毒是一种高度接触性急性呼吸道传染病,给人类健康造成了极大威胁。作为一个已经被证明的抗流感药物靶点,神经氨酸酶在流感病毒复制和传播中发挥重要作用,并且其活性中心的氨基酸组成高度保守。本研究中,我们使用分子对接技术筛选从中草药小分子数据库中筛选神经氨酸酶潜在的抑制剂,结果得到4个亲和力高于奥司他韦(Osel-tamivir)的化合物,并确定了他们的中草药来源。为从草药中提取,设计以及实验合成新的神经氨酸酶抑制剂提供了一定的依据和指导。

硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗H1N1猪流感病毒作用及对神经氨酸酶活性的影响

研究硫酸酯化酵母β-葡聚糖对H1N1猪流感病毒的体外抑制作用及对神经氨酸酶活性的影响。采用细胞感染模型,应用MTT法检测药物对MDCK细胞的半数毒性浓度(TC50)、半数抑制浓度(IC50)及治疗指数(TI),并结合神经氨酸酶抑制试验检测药物对其活性的影响。结果表明,硫酸酯化酵母β-葡聚糖对MDCK细胞最大无毒浓度为5.34 mg/m L,其半数抑制浓度(IC50)为0.58 mg/m L,治疗指数(TI)为18.0;当药物浓度≥1.25 mg/m L时,能明显降低H1N1猪流感病毒神经氨酸酶的活性。提示硫酸酯化酵母β-葡聚糖有确定的体外抑制H1N1猪流感病毒的作用,并能影响病毒神经氨酸酶的活性。

新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制剂细胞水平评价体系的建立

本文旨在建立以2009新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）为靶点的神经氨酸酶抑制剂（Neuraminidase Inhibitors，NAIs）细胞水平评价体系。NA有促进流感病毒释放的作用，本研究应用重组病毒技术，通过将表达NA（A／California／04／2009（H1N1））的质粒、表达流感病毒血凝素蛋白HA（Hemagglutinin）的质粒、以及表达敲除外壳基因并带1有荧光素酶报告基因的HIV-1基因组共转染至病毒生成细胞，产生以HA、NA为外壳蛋白包裹HIV-1核心的重组病毒。

绵马贯众中流感病毒H_5N_1神经氨酸酶抑制剂的筛选

目的:筛选绵马贯众中流感病毒H_5N_1神经氨酸酶(NA,neuraminidase)抑制剂。方法:将绵马贯众中已分离得到的99个化合物建立配体库,从Protein Data Bank(PDB)中下载NA(H_5N_1)的X-ray晶体三维结构文件,采用AutoDock Vina软件筛选出与NA有较好结合作用的化合物,并通过神经氨酸酶抑制实验验证筛选出的化合物对NA的作用。结果:通过分子对接筛选出5个与NA有较好结合的化合物,神经氨酸酶抑制实验结果表明候选化合物中Dryocrassin ABBA对NA的抑制作用最强,IC_(50)为(18.59±4.53)μmol/L。结论:绵马贯众中化合物Dryocrassin ABBA具有较好的抗H_5N_1流感病毒神经氨酸酶的作用。

2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85%,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。

江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子特征分析

目的 ：分析江苏省2013年甲型H1N1（09pdm）流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）变异情况,分析其遗传进化特征。方法 ：按照流感样病例定义,收集江苏省各哨点医院流感样病例标本,阳性样本经病毒分离培养及亚型鉴定。选取2013年不同时间段、不同地区具有代表性的14株甲型H1N1（09pdm）阳性毒株,利用特异性引物扩增HA、NA基因,测序并分析其遗传进化特征。结果 ：14株分离毒株与疫苗株A/California/07/2009（H1N1）的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%~98.4%和96.5%~98.0%。NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~98.9%和97.0%~98.5%。遗传进化分析表明,14株分离株HA和NA基因分属于不同的进化谱系。分子特征表现为HA氨基酸序列出现D114N、K300E、E516K的变异,NA分子特征表现为N44S位点变异。从2013年左右开始甲型H1N1（09pdm）流感基因多样性增加;通过FEL模型得到一个正向压力选择HA氨基酸位点310,一个正向压力选择NA氨基酸位点4,通过REL模型得到9个正向压力选择HA氨基酸位点179、180、239、301、303、310、311、312、313（含位点310）,5个正向压力选择NA氨基酸位点4、23、52、287、374（含位点4）。HA蛋白具有9个潜在糖基化位点,7个位于HA1上,2个位于HA2上;NA蛋白共有9个潜在糖基化位点。14株分离毒株在NA蛋白酶活性中心及周围辅助位点上均未发现变异。结论：2013年江苏省甲型H1N1（09pdm）流感HA、NA基因变异加快,遗传多样性增加,未来的遗传进化值得进一步关注。

神经氨酸酶茎部氨基酸缺失对H5N1亚型禽流感病毒生物学特性的影响

近年来H5N1亚型禽流感病毒（AIV）神经氨酸酶（NA）茎部15—20个氨基酸的自发缺失时有报道，突变对于AIV生物学特性的影响还没有得到系统研究。应用反向遗传操作技术，拯救获得5株具有不同NA茎部长度的H5N1／PR8重组AIV。重组病毒的内部基因和血凝素（HA）基因来源相同，NA基因来源不同，并在NA茎部进行20个氨基酸的删除或添加突变。通过研究其生物学特性发现，5株重组病毒在SPF鸡胚中繁殖良好，其EID50、MDT和平均病毒滴度相似；NA茎部长短影响病毒的解凝能力，长茎病毒红细胞解脱能力比短茎病毒强；NA茎部15或20个氨基酸删除突变提高了重组病毒在MDCK细胞上的繁殖能力，短茎病毒释放出的病毒粒子数量是长茎病毒的10。100倍，释放时间提前6．10h，短茎病毒在MDCK细胞上形成的空斑也明显比长茎病毒的空斑大。实验结果揭示了AIVNA茎部氨基酸缺失突变的生物学意义，NA茎部15或20个氨基酸删除突变增强了AIV的细胞适应性，可能与现阶段H5N1亚型AIV宿主范围进一步扩大有关。利用反向遗传技术成功拯救了5株H5N1／PR8重组流感病毒，为流感病毒基因功能研究和重组疫苗研究建立了技术平台。通过对AIVNA茎部氨基酸的删除突变提高了病毒在MDCK细胞上的繁殖产量，为流感病毒细胞苗的生产提供了新的思路。

2009至2016年中国甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析及流行趋势预测

目的分析2009至2016年中国甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因(NA)进化特征,预测其流行趋势,为流感疫苗评价提供依据。方法从全球共享禽流感数据倡议组织(GISAID)数据库及美国国家生物技术中心(NCBI)数据库下载甲型H1N1流感病毒NA基因序列1 141条。利用邻接法进行系统进化分析和遗传变异分析,利用Bayesian skyline Plot预测流行趋势。结果 2009至2016年中国甲型H1N1毒株NA基因与参考毒株的同源性逐年降低。遗传进化分析显示同一年份的毒株在系统进化树上基本呈现集中分布。除2012年,其余各年份的毒株均通过不同模型得到正向压力选择位点。动力学分析显示2017年甲型H1N1可能达到一个流行高峰。结论甲型H1N1流感病毒NA基因所编码的氨基酸逐年变异,需进一步加强流感监测。

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

【目的】了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律。【方法】分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析。【结果】2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9%～78.8%),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979～2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1%～79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异。【结论】2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况。

吡咯烷类神经氨酸酶抑制剂的设计、合成与初步活性研究

目的合成新型吡咯烷类神经氨酸酶抑制剂,并测定其抑制神经氨酸酶的活性。方法以L-羟脯氨酸为原料,合成一系列神经氨酸酶抑制剂,并用高通量活性筛选方法检测其对神经氨酸酶的抑制活性。结果设计、合成了18个新型的吡咯烷类化合物,其结构经核磁共振氢谱及质谱确定,并发现了几个具有较好活性的化合物。结论吡咯烷类化合物对神经氨酸酶有较高的抑制活性,值得进一步研究。

H_5N_1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

应用RT—PCR方法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NA全基因cDNA。将NA cD-NA克隆于pMD18-T载体,并对其进行了测序。测序结果表明:所克隆的NA基因全长为1416 bp,编码区为1410个核苷酸,编码469个氨基酸。将其序列与5株H5N1亚型禽流感病毒NA基因序列进行比较,其核苷酸和氨基酸同源性均为96.6％～99.1％。NA的克隆和分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。

猪流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定猪流感病毒H1N1 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆猪流感病毒H1N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短),pET32a(+)/NA(截短),pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了猪流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为猪流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物。自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa。分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明:重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。

甲型H1N1流感重症患者病毒血凝素和神经氨酸酶基因特性分析

目的通过分析2009-11—02～12—04期间北京市6例甲型H1N1流感重症患者咽拭子中病毒的血凝素、神经氨酸酶基因特性，了解其基因进化特点，以期对下一步甲型H1N1流感的防控和重症的治疗提供理论依据。方法使用实时荧光PCR方法，检测重症患者样本为甲型H1N1流感病毒阳性样本，利用测序引物扩增血凝素、神经氨酸酶基因，测定核苷酸序列，利用生物信息软件拼接序列；分析重要基因位点，对其进行基因进化、耐药性分析。结果6件测定样本血凝素、神经氨酸酶基因与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）核苷酸、氨基酸的同源性分别为99．2％及99．5％，有8个血凝素基因的氨基酸发生替换，为65、100、145、185、216、220、338及391位，其中145位位于抗原决定簇A区，220位位于抗原决定簇D区，同时是受体结合位点的后壁；有5个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换，为59、106、232、248及365位，其中106、232、248位位于酶活性区域；未发生神经氨酸酶基因275位H→Y的替换。结论北京市甲型H1N1流感重症患者病毒血凝素和神经氨酸酶基因与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）高度同源，部分血凝素基因、神经氨酸酶基因有氨基酸替换，但其作用不清。所有测定样本未发生对达菲类药物的耐药性突变。

用免疫信息学技术设计新型H1N1流感神经氨酸酶抗原表位肽(英文)

神经氨酸酶(NA)是一种具有唾液酸酶活性的流感毒粒表面糖蛋白,切断病毒HA与细胞膜上神经氨酸残基之间的连接,使病毒能够从宿主细胞表面释放.检测了新型H1N1流感NA基因核苷酸序列,用免疫信息学方法预测、筛选和鉴定B细胞表位;人工合成NA抗原多肽SE8和RE6,并免疫新西兰兔制备抗血清.两种抗血清具有体外中和新型H1N1流感病毒能力(微量中和实验),而且还具有拮抗血凝释放作用.根据2009年全球毒株NA基因序列检测和比对结果,发现多肽SE8和RE6序列未变异.实验揭示,多肽SE8和RE6可以作为新型H1N1流感候选多肽疫苗.

姜黄抑制神经氨酸酶活性及活性部位化学成分研究

目的:研究姜黄流感病毒神经氨酸(NA)抑制活性并对其活性部位的化学成分进行分析和鉴定。方法:姜黄依次经石油醚渗漉、乙醇回流提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮提取后得4个提取部位。采用NA抑制剂筛选试剂盒研究不同提取部位及主要单体的抑制活性,并应用UPLC-Q-TOF-MS技术对活性部位的化学成分进行分析和鉴定。结果:姜黄的4个提取部位均显示了一定的NA抑制作用,其中乙酸乙酯提取部位抑制活性最好,并从该活性部位中鉴定了14个化学成分,属于姜黄素和萜类化合物,姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素均显示了一定的NA抑制作用。结论:本研究首次发现姜黄提取物具有较强的NA抑制活性,为抗流感药物的研发提供了科学依据。

神经氨酸酶抑制剂——抗击H1N1病毒的主要药物

神经氨酸酶（NA）抑制剂是一类新的抗病毒药物，对A、B型流感均有抑制作用。神经氨酸酶又称唾液酸酶，是分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白，它具有抗原性，可以催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色。

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(49～1 587 bp)、pMET A/NA(121～1 200 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。

2009年-2014年云南边境禽流感病毒H5N1亚型神经氨酸酶基因进化分析

为了解云南边境禽流感病毒H5N1亚型神经氨酸酶(NA)基因变异及进化特征,2009年-2014年期间在云南边境采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品1 500份,经禽流感H5/N1亚型病毒特异性多重RT-PCR检测,对阳性样品进行病毒NA基因扩增、纯化、克隆和测序,并与已知毒株和参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果从1 500份样品中检出禽流感病毒H5N1亚型阳性样品60份;60阳性样品病毒HA基因测序获得21种NA序列,可划分为4个不同进化分支。NA基因与HA基因呈现不同进化关系;云南边境毒株NA aa275位点未发生变异,因此变异毒株对神经氨酸酶抑制剂Oseltamivir(达菲)类抗病毒药物可能无抗性或耐药性;2009年-2014年期间云南边境H5N1亚型病毒NA间具有遗传差异,NA基因进化分支4已成为当地流行的优势毒株。