朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞N2a的毒性研究

采用Annexin V-FITC/PI双重染色的流式细胞检测和细胞凋亡的形态学观察,探讨了朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞系N2a细胞的毒性作用。结果表明:15、25和50μmol/L浓度的PrP 106-126作用于N2a细胞24 h均引起了细胞明显的形态学变化,提高了细胞凋亡率(P<0.05),且浓度越大,凋亡效果越明显;在浓度为25μmol/L时,PrP 106-126作用N2a细胞48 h引起的毒性作用明显大于24 h,而100μmol/L PrP 106-126作用N2a细胞12 h并未引起细胞凋亡(P>0.05)。试验还表明PrP 106-126对神经细胞产生的毒性是淀粉样纤维物质作用细胞逐渐造成的结果。

抑制beclin-1信号通路对缺血再灌注后神经母细胞瘤N2a细胞自噬的影响

目的观察抑制beclin-1信号通路对缺血再灌注后神经母细胞瘤N2a细胞自噬的影响。方法体外培养神经母细胞瘤系N2a细胞,脂质体转染beclin-1的miRNA干扰质粒,以缺氧、缺营养方式模拟缺血再灌注,甲基噻唑基四唑法检测各组N2a细胞活性,免疫印迹法测定各组N2a细胞beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,电镜观察该细胞自噬活性。结果在缺血90min、再灌注24h干扰组较相应假干扰组细胞活性明显升高(P<0.05);干扰组beclin-1和Caspase3表达水平明显低于相应的假干扰组(P<0.05),但两组之间LC3表达无明显差异(P>0.05);而在缺血30min再灌注24h细胞活性,beclin-1、Caspase3和LC3的表达真假干扰组间无明显差异(P>0.05)。电镜下在正常组没有观察到细胞自噬现象;在缺血30min和90min再灌注24h,真假干扰组均观察到明显的细胞自噬现象,且两组间无明显差异。结论缺血90min,再灌注24h时,干扰beclin-1的表达虽不能明显改变N2a细胞自噬水平,却减少了凋亡,有利细胞存活。

PrP106-126诱导的小鼠成神经瘤N2a细胞NF-κB激活及神经毒性研究

PrP106-126诱导的神经毒性机制仍不清楚。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用WesternBlot方法首次发现PrP106-126导致核转录因子NF-κB的亚单位p65蛋白转移到细胞核内,激活了NF-κB细胞信号分子。转核抑制剂NF-κB SN50预处理细胞减弱了PrP106-126诱导的NF-κB激活程度;并且DNA Ladder凋亡检测及Annexin V-FITC和PI双染流式细胞凋亡检测发现,NF-κB SN50能够抑制p65蛋白转核,在一定程度上也抑制了PrP106-126对N2a细胞的神经毒性效果。结果表明NF-κB信号分子参与了PrP106-126的神经毒性,且NF-κB信号分子的激活对N2a细胞具有促凋亡作用。PrP106-126激活N2a细胞NF-κB信号分子以及NF-κB促凋亡功能的体外研究对于阐明朊病毒病致病机理具有重要意义。

AKT-糖原合成激酶-3β信号通路对SOD1G93A突变N2a细胞的保护作用

目的探讨AKT-糖原合成激酶-3β(GSK-3β)信号通路对SOD1G93A突变N2a细胞的作用及机制。方法选取小鼠成神经瘤细胞系N2a,分别转染p EGFP-WT-SOD1和p EGFP-G93A-SOD1质粒,应用Western blotting和免疫荧光染色方法检测AKT、GSK-3β和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在细胞模型中的表达变化。应用RT-PCR和Western blotting技术检测siRNA沉默AKT后GSK-3β和cyclin D1在SOD1突变N2a细胞中的表达变化,通过MTS方法,检测细胞增殖和存活的改变。结果与p EGFP-WT-SOD1转染的N2a细胞比较,p EGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中AKT及GSK-3β总蛋白在转染后24 h和48 h表达均无明显变化,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1表达均升高。免疫荧光染色结果显示,转染后24 h和48 h,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1在p EGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中表达均升高。应用siRNA沉默AKT后与对照组相比,在转染后48 h和72h,AKT、p-AKT(Ser473)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1蛋白均降低。MTS实验结果显示,在AKT沉默后72h、96 h、120 h,N2a细胞增殖和活力降低。结论 SOD1G93A突变影响N2a细胞中AKT、GSK-3β翻译后磷酸化修饰及cyclin D1的表达,AKT可能通过调控GSK-3β和cyclin D1影响SOD1G93A突变N2a细胞的增殖和存活。

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75^NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。

miR-29b通过抑制N2a细胞p53凋亡通路减轻氧糖剥夺/再灌注损伤

目的探讨微小核糖核酸(miR)-29b过表达是否抑制脑缺血损伤,进一步探讨其潜在机制。方法体外培养小鼠成神经细胞瘤N2a细胞,构建氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,模拟体外脑缺血损伤。N2a细胞随机分为空白对照组、OGD/R组、OGD/R+转染miR-29b激动剂组、OGD/R+转染miR-29b抑制剂组、转染miR-29b激动剂阴性对照组、转染miR-29b抑制剂阴性对照组。实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测各组miR-29b表达,溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)法检测miR-29b激动剂和抑制剂对OGD/R诱导细胞活性和凋亡的影响,Hoechst 33258染色法观察N2a细胞形态学特征及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)-3活性,免疫印迹法定量分析促凋亡蛋白Bax、Bcl-2及p53表达。结果经OGD/R处理的N2a细胞中miR-29b水平明显降低。miR-29b激动剂显著增加细胞活力,减少LDH漏出率,改善细胞核在凋亡过程中形态学变化,增强OGD/R条件下caspase-3活性;miR-29b抑制剂加剧OGD/R诱导的细胞毒性和细胞凋亡。miR-29b激动剂阻断OGD/R诱导的Bax和p53蛋白表达增加,降低Bcl-2蛋白表达;miR-29b抑制剂加剧OGD/诱导的这些凋亡相关蛋白改变。p53基因敲除的p53 si RNA降低细胞活力,增加LDH漏出率,逆转miR-29b激动剂对细胞损伤的改善作用。结论 miR-29b通过负调控p53依赖性凋亡途径减轻脑缺血性损伤,可能为缺血性脑卒中提供一潜在的治疗靶点。

高内涵筛选结合活细胞实时成像技术分析谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡

目的利用高内涵筛选(high-content screening,HCS)技术结合活细胞实时成像技术研究谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡的形态学变化特征。方法用HCS技术分析摸索不同浓度谷氨酸诱导的N2a细胞早期凋亡百分比的变化,同时结合活细胞实时成像技术追踪谷氨酸诱导的N2a凋亡的形态学变化特征。结果当谷氨酸浓度为750μg/mL时,发生早期凋亡的N2a细胞比例达到峰值(42.07%)。对同一谷氨酸浓度,随着拍摄追踪时间的增加,凋亡细胞数目逐渐增多,胞核荧光强度的变异系数逐渐增大,胞核面积逐渐缩小,胞核逐渐出现碎片化。结论使用HCS结合活细胞实时成像技术能直观清晰地捕捉谷氨酸诱导N2a细胞凋亡的形态学变化特征,是一种体外追踪单一细胞凋亡形态学变化的可靠方法。该方法也可应用于药物对细胞凋亡的促进或抑制作用的形态学变化特征的研究。

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞不同分化培养方法的比较

目的:比较5种不同分化培养方法对小鼠神经母细胞瘤N2a细胞形态、分化情况、分化标志物及增殖、凋亡的影响。方法:N2a细胞分别以D10[DMEM+10%胎牛血清(FBS)]完全培养基和不同分化培养基D1(DMEM+1%FBS)、D0(不含FBS的DMEM培养基)、30%OM(DMEM+30%Opti-MEMⅠ)、D2+视黄酸(RA)(DMEM+2%FBS+10μmol·L-1 RA)和D1+RA(DMEM+1%FBS+10μmol·L-1RA)培养后显微镜眀场随机拍照,观察不同时间点的分化比例、突起长度及突起数量;免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测神经元标志物的表达;EdU掺入流式细胞术、CCK-8和AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测不同培养方法对细胞增殖和凋亡的影响。结果:中等密度培养条件下D0组72 h分化比例为(35.92±2.63)%,D1、30%OM、D2+RA和D1+RA组96 h分化比例分别为(10.40±2.05)%、(29.70±4.98)%、(11.37±2.56)%和(45.13±8.75)%;分化后神经元标志物微管蛋白beta-Ⅲ(βⅢ-tubulin)和生长相关蛋白43(GAP43)表达上调。D0组分化培养24 h后即可见长突起,突起以单支为主,但增殖能力较D10和30%OM组低,凋亡和死亡比例高,72 h后细胞状态差,大部分死亡。D1+RA组分化培养24 h也可见长突起,细胞呈多支生长,增殖能力也较D10和30%OM组低,凋亡和死亡比例高。30%OM组分化72 h才见较长突起,突起以两支为主,细胞增殖能力较D10组略低,但凋亡与D10组无显著差异。在低密度培养条件下30%OM可实现长时间分化培养,分化比例随培养时间的延长而增加,培养144 h分化比例达(56.22±6.27)%,突起长度(176.73±108.61)μm。结论:D0、30%OM和D1+RA分化培养方法均可实现较高比例的分化,D0和D1+RA分化和长突起的出现早于30%OM,但细胞增殖率低,凋亡比例高,不利于长时间培养;30%OM培养在低密度下可实现高分化比例和长突起,适合长时间分化培养。

实时荧光定量PCR构建朊病相关蛋白p38 MAPK标准品质粒和标准曲线

为进一步揭示朊病的治病机理,根据GenBank中的小鼠p38MAPK的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从N2a细胞中扩增和克隆了该蛋白的309 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了p38MAPK标准曲线及其直线回归方程。所构建的标准曲线的相关系数r2=0.999,说明成功构建小鼠N2a细胞p38MAPK基因的标准质粒和标准曲线,为研究朊病的发病机理奠定了分子生物学基础。

蝙蝠葛碱拮抗缓激肽引起的钙稳态改变及细胞骨架蛋白的异常磷酸化(英文)

为研究蝙蝠葛碱(dauricine,Dau)拮抗缓激肽(bradykinin,BK)诱导的Alzheimer样钙稳态失衡及细胞骨架蛋白异常磷酸化的作用,采用双波长荧光分光光度计测定细胞内钙离子浓度([Ca2+]i),用MTT法检测细胞代谢水平,用免疫组织化学方法观察tau蛋白表达和磷酸化.结果表明,Dau(3滋mol/L,6滋mol/L)可抑制BK诱导的[Ca2+]i升高,保护BK引起的神经元代谢降低,拮抗BK引起的tau蛋白异常磷酸化和聚集.结果提示:Dau可拮抗BK诱导的Alzheimer样钙稳态失衡及细胞骨架蛋白异常磷酸化的作用.

手性修饰氧化石墨衍生物对小鼠成神经瘤细胞活性的影响

目的比较手性修饰的氧化石墨（GO）衍生物对小鼠成神经瘤细胞N2a活性的影响。方法倒置荧光显微镜观察N2a细胞形态,MTT法检测N2a细胞的活性。结果在0.1-0.4μmol/L浓度GO衍生物对N2a细胞活性影响呈浓度相关,其中0.4μmol/L的GO衍生物对N2a细胞生长状况最好;L-型GO（L-GO）和D-型GO（D-GO）促N2a细胞增殖率分别为94%和52%,二者差异有统计学意义（P〈0.01）。结论手性修饰的GO衍生物在0.1-0.4μmol/L能促进N2a细胞生长,L-GO促进N2a细胞生长活性比D-GO强。

小鼠神经母细胞瘤细胞中神经型钙黏蛋白超表达对突起形成及连环蛋白表达的影响

目的探讨神经型钙黏蛋白(N-cadherin)调控连环蛋白(catenin)对小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)形态的影响。方法构建鼠源的N-cadherin融合蛋白超表达载体,利用脂质体转染的方法将空载体pCAG-MCS-EGFP和超表达载体pCAG-N-Cad-EGFP分别转染至N2a细胞,作为对照组和实验组;细胞划痕和黏附实验检测Ncadherin超表达对N2a细胞迁移和黏附的影响,免疫荧光检测N-cadherin超表达对N2a细胞形态的影响,并结合Western blotting检测连环蛋白家族的表达情况。结果与对照组相比,N-cadherin超表达促进细胞突起的形成,使得N2a细胞突起增多和伸长; N-cadherin超表达增强了黏附性而抑制了细胞的迁移能力; N-cadherin超表达使得细胞内连环蛋白家族中α-catenin、β-catenin和p120蛋白表达均显著上升(P <0. 05),而γ-catenin表达下降但差异不显著(P> 0. 05);另外,N-cadherin超表达的细胞有明显的聚集现象。结论 N-cadherin超表达促进N2a细胞突起形成,增强细胞的黏附性从而抑制细胞的迁移能力,调控连环蛋白家族成员的表达并促使细胞聚集。