基于PINK1-Parkin线粒体自噬通路探讨海昆肾喜含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用

目的研究海昆肾喜(haikun shenxi,HKSX)含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用及机制。方法制备HKSX含药血清,高效薄层色谱(high performance thin layer chromatography,HPTLC)对其成分进行分析。应用含药血清干预N2a/APP695细胞,MTT检测HKSX含药血清的细胞毒性;ELISA检测Aβ_(1-42)含量;JC-1法检测线粒体膜电位、DCFH-DA法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ATP检测试剂盒检测三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)评价线粒体功能;免疫印迹法(Western blot)检测PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin、p62、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated-proteinlight chain-3,LC3)及p-Tau S396蛋白的表达;设置线粒体自噬抑制剂Mdivi-1干预组,Western blot检测PINK1、Parkin、p-Tau S396蛋白表达,ELISA检测Aβ_(1-42)含量,验证HKSX的神经保护作用是否与线粒体自噬密切相关。结果与模型对照组(MC)相比,HKSX低、中、高剂量组Aβ_(1-42)含量明显降低,高剂量组尤为明显(P<0.01);线粒体膜电位及ROS含量明显降低(P<0.01)、ATP含量升高(P<0.01);PINK1、Parkin(P<0.01)及LC3Ⅱ(P<0.01)的表达增加,而p62的表达降低(P<0.01),p-Tau S396蛋白亦降低(P<0.01);而Mdivi-1的干预,在很大程度上抑制了HKSX对PINK1、Parkin蛋白的活化(P<0.01)及对p-Tau S396和Aβ_(1-42)的清除(P<0.01),表明HKSX的神经保护作用依赖于PINK1-Parkin信号通路。结论HKSX能够提高线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin蛋白的表达,激活线粒体自噬,提高线粒体功能,抑制Aβ及p-Tau S396蛋白在神经细胞中的沉积,发挥神经保护作用,从而起到防治AD的效果。

50 Hz磁场暴露对Neuro2a/APP(695)细胞基因转录的影响

目的研究50 Hz磁场暴露对Neuro2a/APP(695)细胞基因转录的影响。方法Neuro2a/APP(695)细胞简单随机分为假性辐照组和磁场暴露组(n=3)。暴露条件为1.0 mT 50 Hz正旋波磁场,4 h/d,连续3 d;假性辐照组细胞除无磁场暴露外,余同磁场暴露组。暴露结束后按标准方法送样,进行转录组测序检测,包括样品RNA提取、数据质量评价和数据分析等。结果50 Hz磁场暴露后Neuro2a/APP(695)细胞有141种定性的基因表达发生了明显的变化,其中有129种表达上调、12种表达下调。GO富集分析结果显示,Neuro2a/APP(695)细胞中62种上调差异表达基因涉及432类显著GO功能富集,其中涉及生物学过程337类、细胞组分16类、分子功能79类;3种下调差异表达基因共涉及275类显著GO功能富集,其中涉及生物学过程260类、细胞组分5类、分子功能10类。KEGG通路分析显示,这些差异基因可能参与了20条KEGG通路,其中2个下调差异表达基因通路,18个上调差异表达基因通路。结论50 Hz磁场暴露可能对Neuro2a/APP(695)细胞的黏附连接、Hippo信号通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素、蛋白消化和吸收和甘露糖型O-聚糖生物合成等方面产生影响,以上通路可能是50 Hz磁场对Neuro2a/APP(695)细胞产生影响的主要途径。

咪达唑仑对氧葡萄糖剥夺后N2a/APP695细胞β淀粉样蛋白的抑制作用及机制

目的探讨咪达唑仑对被剥夺氧和葡萄糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)后的N2a/APP695细胞淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢变化的影响及机制。方法将处于对数生长期的N2a/APP695细胞用平衡盐缓冲液冲洗后随机分为空白组、对照组及实验组。空白组未经OGD处理,在正常培养箱内培养;对照组行OGD处理后继续培养复氧;实验组在OGD处理后加入不同浓度(分别为70、100、125、150 ng/ml)的咪达唑仑继续培养复氧。24 h后用AnnexinV-FITC/双染法流式细胞术检测各组细胞凋亡比例;用Western blot方法检测各组细胞的Caspase-3、Aβ1-42、解整合素金属蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10)、β-淀粉样前体蛋白水解酶1(β-site APP cleavage enzyme-1,BACE1)、早老素1(presenilin 1,PS1)蛋白水平。结果与空白组相比,对照组的细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ1-42、BACE1及PS1水平显著升高(P<0.05);APP及ADAM10水平无明显变化(P>0.05)。与对照组相比,实验组细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ1-42显著下降(P<0.05);咪达唑仑70 ng/ml组BACE1显著下降(P<0.05),而APP、ADAM10及PS1无明显变化(P>0.05)。结论OGD可通过上调BACE1及PS-1导致Aβ1-42表达增加促使细胞凋亡;而咪达唑仑可通过下调BACE1减少Aβ1-42表达进而减少神经细胞凋亡,发挥对OGD损伤后N2a/APP695细胞的保护作用。

Genistein对APP695基因转染PCI2细胞Caspase-3表达的影响

目的利用APP695MT基因转染PCI2细胞为细胞模型，观察植物雌激素三羟基异黄酮（GST）对PCI2细胞中Caspase-3表达的影响，初步探讨GST对表达APP695MT基因PCI2细胞的保护作用及其相关机制。方法将培养的PCI2细胞分为正常对照组、APP695转染组、GST干预组，免疫细胞化学SABC法检测凋亡相关蛋白Caspase-3在不同处理组PCI2细胞中的表达变化。，结果正常纽及空载组Pc12细胞Caspase-3阳性表达非常弱；与正常对照组比较，APP695转染组PCI2细胞Caspase-3为强阳性表达（P〈0.01）；GST干预组与APP695转染组比较．Caspase-3的免疫反应产物明显减弱（P〈0．01），且15Ixmol／L和201xmol／LGST处理组与5txmol／L和10gmol／LGST处理组比较，Caspase-3的免疫反应产物减弱更明显（P〈0．01）。结论APP695基因转染的PCI2细胞中凋亡蛋白Caspase-3的表达明显增强，GST的干预能显著降低其表达，对神经细胞产生保护作用。

HuD在N2aAPP细胞和APP/PS1转基因小鼠中的表达

目的研究RNA结合蛋白HuD在AD细胞和动物模型中的表达水平,探讨HuD与AD的关系;明确PI3K/AKT通路对神经细胞HuD表达的调控作用。方法免疫荧光检测HuD在C57BL/6小鼠脑组织中的表达水平;构建过表达APP的N2a APP细胞模型,Western blot检测HuD的表达情况;购买APP/PS1转基因小鼠,Western blot检测HuD在脑组织中的表达情况;应用LY294002处理3种神经细胞(N2a、SH-SY5Y和HT22),阻断PI3K/AKT通路,观察该通路对HuD的调控作用。结果 HuD在整个C57BL/6小鼠脑组织中均有表达,且在海马体的颗粒细胞尤为明显;在N2a APP细胞,HuD的表达水平明显低于对照组;APP/PS1转基因小鼠脑组织中的HuD水平也低于野生对照鼠;LY294002处理下调了HuD在神经细胞中的表达水平。结论 HuD在N2a APP细胞和APP/PS1转基因小鼠中均呈低表达;HuD在神经细胞中受PI3K/AKT通路的调控,为研究HuD与AD的关系及寻找新的AD诊断和治疗靶点提供了理论基础。

PACS-2在阿尔茨海默病发展中作用机制研究

目的探究磷酸呋喃酸性簇分选蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)在N2a/APP695swe细胞线粒体功能及细胞凋亡中的参与作用,进一步探讨PACS-2在阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)发生、发展中的作用及意义。方法CCK8法分析不同浓度的二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbeneglycoside,TSG)处理N2a/APP695swe细胞48h后的细胞存活率,选择合适浓度的TSG用于后续实验。体外常规培养N2a/WT细胞和N2a/APP695swe细胞,实验细胞分为3个组:空白对照组(WT组):N2a/WT细胞;模型组(APP组):N2a/APP695swe细胞;治疗组(TSG组):N2a/APP695swe细胞,合适浓度的TSG干预。TUNEL法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,JC-1法流式检测细胞线粒体膜电位,Westernblot(WB)检测PACS-2的蛋白表达情况,RT-qPCR检测PACS-2的mRNA表达情况。结果CCK8法分析不同浓度的TSG作用细胞48h后的细胞存活率:100μmol/L的TSG保护作用最显著,差异有统计学意义(P<0.01);TUNEL法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,与WT组相比,APP组的凋亡率升高,与APP组相比,TSG组的凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05);JC-1法检测细胞线粒体膜电位;与WT组相比,APP组的膜电位降低,与APP组相比,TSG组膜电位升高,差异有统计学意义(P<0.05);WB检测PACS-2的蛋白表达:与WT组相比,APP组的PACS-2表达升高,与APP组相比,TSG组的PACS-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR检测PACS-2的mRNA表达:与WT组相比,APP组的PACS-2表达升高,与APP组相比,TSG组的PACS-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PACS-2在AD的发生、发展中有重要作用,其上调可能促进AD的发生,脑保护药物TSG可能通过下调PACS-2抑制AD模型细胞凋亡并改善线粒体功能发挥细胞保护作用。

三羟基异黄酮对APP695基因转染PC12细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

目的观察植物雌激素三羟基异黄酮（genistein，GST）对APP695基因转染PCI2细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。方法用pIRES2-EGFP空载体和pIRES2-EGFP／APP695MT表达载体转染正常PCI2细胞，将细胞分为正常对照组、空载转染组、APP695转染组和GST干预组（5tLmol／L、15Ixmol／L）。采用免疫细胞化学SABC法和免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2在PCI2细胞中的表达。结果免疫细胞化学SABC法结果显示，与正常对照组比较，APP695转染组PCI2细胞Bax蛋白细胞阳性表达率显著升高[（78．02±1．26）％，P〈0．01）]，Bcl-2蛋白细胞阳性表达率则明显降低[（15．40±0．72）％，P〈0．01）]；15~mol／LGST组与APP695转染组比较，Bax蛋白的阳性细胞表达率显著降低[（22．35±0．49）％，P〈0．01）]，而Bcl-2蛋白的阳性表达率明显增强[（68．11±0．24）％，P〈0．01）]。Westernblot结果表明，APP695转染组与对照组比较Bax蛋白的表达量明显增多，Bcl-2蛋白表达则明显降低；GST各处理组与APP695转染组比较，Bax蛋白的表达量明显降低，Bcl-2蛋白表达显著增强。结论GST能降低APP695基因转染引起的PCI2细胞内Bax蛋白表达的水平，而提高Bcl-2蛋白的表达水平，对PCI2细胞产生保护作用。