蝉花中N^(6)-(2-羟乙基)-腺苷提取工艺优化及结构鉴定

在单因素实验基础上,采用响应面法考察液料比、水浴温度、水浴时间对提取物中N6-(2-羟乙基)-腺苷[N^(6)-(2-hydroxyethyl) adenosine,HEA]含量的影响,优化出HEA的最佳提取工艺:以超纯水为溶剂、液料比118∶1、超声时间25 min、水浴温度24℃、水浴时间3.8 h,获得提取物中HEA含量为(0.836±0.030) mg·g^(-1)。采用大孔树脂、酸性氧化铝层析柱和半制备高效液相色谱仪(semi preparative high performance liquid chromatography,SP-HPLC)分离纯化提取液中HEA,采用核磁共振及电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)和核磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy,^(1)H NMR)鉴定分离出的物质为HEA,经高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分析其纯度为99.32%。

蛹虫草子实体中N6-(2-羟乙基)-腺苷的分离纯化及抗肿瘤作用

为明确蛹虫草(Cordyceps militaris)核苷类化合物HPLC图谱中未知峰化学成分,运用NKA-II大孔吸附树脂、C-18柱分离纯化和结晶等方法,从蛹虫草子实体水提物中得到了未知峰的结晶粉末,通过1 HNMR,13 CNMR、ESI-MS等波谱分析,鉴定出化合物为N6-(2-羟乙基)-腺苷。该化合物对K562肿瘤细胞具有抑制作用,半数抑制有效浓度为0.1μmol/mL。

细脚棒束孢E3菌株产N^6-(2-羟乙基)腺苷的培养基及前体物筛选

为研究有利于E3菌株产N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine,HEA]的培养基组分、前体物及氨基酸,以查氏培养基作为基础培养基,液体静置发酵,分别对碳氮源、无机盐、前体物和氨基酸进行筛选,结果表明:碳、氮源最好的是淀粉和(NH4)2HPO4;无机盐只有钾盐能促进菌株产生HEA,效果最好的是KH2PO4;前体物和氨基酸中腺苷和腺嘌呤促进菌株累积HEA能力相同,精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸、色氨酸、L-谷氨酸和丝氨酸等均能促进菌株产HEA,精氨酸效果最好,菌丝体中HEA含量达2068.21±55.34μg/g,HEA产量达13.10±1.48mg/L。

细脚棒束孢E3菌株产N6-(2-羟乙基)腺苷的液体发酵条件优化

以N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine,HEA]的产量为评价指标,查氏培养基为基础培养基,分别筛选液体静置发酵的光照、温度、时间、培养基初始pH、装液量和接种量,结果表明:有利于细脚棒束孢(Isaria tenuipes)E3菌株产HEA的发酵条件为黑暗或荧光、黄光,培养温度为25~28℃,培养时间为110d,培养基的初始pH为6.0~7.0,装液量为50%,接种量为2.5%。

不同大孔树脂对粉被虫草中N^6-(2-羟乙基)腺苷的分离特性研究

为选择合适的大孔树脂分离粉被虫草中的N6-(2-羟乙基)腺苷(HEA),通过静态吸附与解吸附试验对4种大孔树脂吸附和解吸附HEA的效果进行比较,并对洗脱条件进行优化。结果表明DM-130树脂对HEA的吸附量最大、解吸率较高;该树脂的最佳动态吸附条件是上样量为2倍树脂床体积(BV),吸附时间为6 h;最佳动态洗脱条件是依次用3 BV蒸馏水,1 BV 5%乙醇和3.5 BV 10%乙醇冲洗柱床。在该条件下,经HPLC分析测定,洗脱液中HEA的峰面积百分比达到89.15%。

FTO介导m6A修饰的PRKD2调节SIRT1/HIF-1α通路抑制糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究

目的探究脂肪含量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白激酶D2(serine-threonine kinase protein kinase D2,PRKD2)在糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)进展中的调控作用和调节机制。方法采用35 mmol/L葡萄糖对足细胞(MPC5细胞)进行高糖刺激24h构建DKD体外模型。采用FTO过表达载体(pcDNA-FTO)和PRKD2过表达载体(pcDNA-PRKD2),或空载体(vector)转染高糖诱导的MPC5细胞。通过RT-qPCR检测FTO和PRKD2过表达效率;MeRIP检测PRKD2 mRNA的N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰水平;ELISA检测Caspase-3活性、IL-6,TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)分泌量;流式细胞术分析细胞凋亡率;Western blot评估FTO和PRKD2蛋白水平,以及SIRT1/HIF-1α通路关键蛋白表达水平;Pearson分析FTO和PRKD2水平的相关性。结果与无高糖诱导对照组比较,高糖诱导的足细胞中FTO蛋白(0.51±0.04 vs 1.00±0.03)和PRKD2蛋白(0.45±0.03 vs 1.01±0.04)水平显著下调,差异具有统计学意义(t=13.17,16.76,均P<0.001)。高糖诱导的足细胞中FTO蛋白水平和PRKD2蛋白水平呈正相关(r2=0.7051,P<0.001)。与vector组相比,pcDNA-FTO组PRKD2 mRNA的m6A水平(0.56±0.09 vs1.01±0.13)降低,PRKD2 mRNA水平(3.16±0.14 vs 1.03±0.02)显著升高,差异具有统计学意义(t=51.37,11.82,均P<0.001)。与control组(IL-6:512.76±61.85 pg/ml,TNF-α:28.17±2.83 pg/ml,MCP-1:157.31±17.69 pg/ml)和vector组(IL-6:498.41±87.51 pg/ml,TNF-α:26.35±5.47 pg/ml,MCP-1:165.52±16.87 pg/ml)比较,pcDNA-PRKD2组IL-6(301.86±21.85 pg/ml),TNF-α(11.06±4.12 pg/ml),MCP-1分泌量(81.45±9.03pg/ml)显著减少,差异具有统计学意义(F=7.51,10.47,61.97,均P<0.01)。与control组(Caspase-3:689.65±79.5U/L,细胞凋亡率:22.31%±2.69%)和vector组(Caspase-3:715.91±113.58 U/L,细胞凋亡率:21.07%±3.28%)比较,pcDNA-PRKD2组Caspase-3活性(437.64±104.76 U/L)和细胞凋亡率(8.41%±3.15%)下降,差异具有统计学意义(F=2.35,79.13,均P<0.01)。与control组(SIRT1:1.01±0.05,HIF-1α:1.03±0.07)和vector组(SIRT1:0.97±0.05,HIF-1α:1.02±0.03)相比,pcDNA-PRKD2组SIRT1蛋白(3.51±0.15)水平升高,HIF-1α蛋白(0.37±0.07)水平降低,差异具有统计学意义(F=31.54,8.31,均P<0.01)。结论FTO介导m6A修饰的PRKD2通过SIRT1/HIF-1α通路抑制高糖诱导的足细胞炎症反应和细胞凋亡。

HPLC法检测蝉拟青霉中N6-(2-羟乙基)-腺苷含量

为了建立蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)5704s中N6-(2-羟乙基)-腺苷(HEA)含量测定方法,以去离子水为溶剂,采用超声辅助水浴法提取HEA,基于HPLC法测定其含量。经优化确定色谱条件为Agilent ZORBAX Extend-C色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇∶5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),梯度洗脱,检测波长为260 nm,流速为1.0 mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL。结果显示,HEA浓度为0.25~100.00μg/mL时,峰面积和HEA含量之间线性关系良好,R^(2)=0.9999,仪器的检出限为0.25μg/mL,平均回收率为97.73%~108.95%,RSD为0.37%~1.29%,测得样品中HEA含量为0.78 mg/g。该方法简便、快捷、准确、稳定,适用于蝉拟青霉5704s菌丝体中HEA的测定。

蛹虫草N6-(2-羟乙基)腺苷与多糖组合给药对小鼠睡眠的影响

为开发出预防和治疗失眠的食用菌保健食品或药品,以蛹虫草为原料获得虫草多糖和N6-(2-羟乙基)腺苷,采用45%的虫草多糖配比55%的N6-(2-羟乙基)腺苷组合给药小白鼠,通过小鼠自发活动实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验等,观察组合给药对小鼠镇静催眠的的影响,并进一步开展小鼠急性毒性实验初步考察配比给药的安全剂量。结果:N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖在实验配比条件下给药,可改善小鼠睡眠质量,与单独N6-(2-羟乙基)腺苷给药相比,提高了小鼠入睡率。

脂肪酸合成酶基因的N6-甲基腺苷异常修饰与2型糖尿病的关联性研究

目的探讨脂肪酸合成酶(FASN)mRNA的N6-甲基腺苷(m^(6)A)异常修饰与2型糖尿病(T2DM)之间是否存在关联。方法选择2021年12月至2022年12月期间在首都医科大学宣武医院神经介入科行颈动脉内膜剥脱术的40例T2DM患者及50例健康对照作为研究对象。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和RNA甲基化免疫沉淀定量聚合酶链反应(MeRIP-qPCR)技术检测研究对象脂肪组织中FASN mRNA表达水平和FASN mRNA的m^(6)A修饰水平。随后在首都医科大学宣武医院健康管理中心2018至2023年“功能社区队列”中应用巢式病例对照研究设计,以2018年为基线,以5年后的新发T2DM者为新发T2DM组(87例),按1∶1个体匹配方法匹配健康对照者作为对照组,在外周血中对结果进行验证。采用t检验比较不同组别间FASN mRNA表达水平和FASN mRNA的m^(6)A修饰水平的差异,并采用Spearman相关分析法分析两者的相关性。使用多因素二元logistic回归模型评估FASN mRNA的m^(6)A修饰水平与T2DM的关联强度。构建受试者工作特征(ROC)曲线,评价FASN mRNA的m^(6)A修饰水平预测T2DM的能力。结果无论在脂肪组织还是外周血中,与对照组比较,T2DM组患者的FASN mRNA均高表达(脂肪组织分别为1.30±0.38和0.70±0.30,P<0.001;外周血分别为1.25±0.76和1.02±0.45,P<0.01),而FASN mRNA的m^(6)A修饰水平较低(脂肪组织分别为0.53±0.24和0.84±0.53,P<0.001;外周血分别为0.67±0.55和1.54±0.87,P<0.001),且两者呈负相关(脂肪组织r=-0.360,P<0.001;外周血r=-0.192,P<0.05)。基线外周血FASN mRNA的低m^(6)A修饰水平是T2DM发病的危险因素(OR=5.71,95%CI 1.73~18.85)。ROC曲线结果显示,FASN mRNA的m^(6)A修饰水平对T2DM的预测效果较好(曲线下面积0.817,95%CI 0.753~0.888)。结论FASN mRNA的m^(6)A异常修饰与T2DM存在关联,且FASN mRNA的m^(6)A修饰水平对T2DM有较好的预测价值。

2型糖尿病与肠道菌群及N6-甲基腺苷甲基化的研究进展

肠道菌群与2型糖尿病(T2DM)等代谢性疾病的发生发展密切相关,但具体机制尚不明确。随着表观遗传学研究的深入以及高通量测序技术的发展,表观遗传被提出可能为菌群影响T2DM发生发展的重要机制之一。N6-甲基腺苷(m6A)作为RNA甲基化最常见的表观遗传修饰,可在基因组转录后修饰的角度上解释生理以及疾病状态下总体代谢能力的变化。肠道菌群及其代谢产物作为环境因素,以为机体提供重要的甲基化供体等方式,影响宿主m6A甲基化修饰水平,这可能与T2DM及其并发症中特殊的甲基化改变相关。该文总结了近年来T2DM及其并发症中m6A甲基化的相关研究进展,整理了肠道菌群通过调控m6A甲基化水平影响糖代谢功能的可能机制途径,提出了该研究领域目前需要解决的科学问题。

5'-酰胺腺苷衍生物的合成

N6-苯甲酰基-2',3'-O-异亚丙基-5'-(N-甲基-N-甲氧基酰胺)腺苷,Weinreb酰胺腺苷衍生物是用于制备Weinreb酮腺苷衍生物的重要中间体。报道了N6-苯甲酰基-2',3'-O-异亚丙基-5'-(N-甲基-N-甲氧基酰胺)腺苷的合成方法,以2',3'-O-异亚丙基腺苷为原料,经苯甲酰化、氧化反应和酰胺化反应,总收率为45%,其结构经1H NMR,13C NMR和HRMS表征。

基于数据库挖掘乳腺癌m6A甲基化关键调控因子及其与临床病理和预后的关系

目的:探索N6-甲基腺苷(m6A)甲基化关键调控因子HNRNPA2B1在乳腺癌组织中的表达与乳腺癌临床病理和预后的关系。方法:首先利用数据库检测乳腺癌与正常乳腺组织中m6A甲基化调控因子表达水平,采用LASSO回归和STRING蛋白相关性方法筛选出m6A甲基化关键调控因子,然后利用新疆医科大学附属肿瘤医院145例乳腺癌石蜡标本行免疫组织化学检测其表达情况,分析其与乳腺癌患者临床病理及预后关系。结果:基于数据库筛选出与乳腺癌发生发展密切相关的m6A甲基化关键调控因子HNRNPA2B1;免疫组织化学检测显示,HNRNPA2B1高表达与激素受体(HR)低表达、人表皮生长因子受体2扩增、Ki67高表达、淋巴结转移、组织学高分级等不良临床病理因素明显相关(P<0.05);预后分析显示,HR表达、组织学分级、HNRNPA2B1表达是影响乳腺癌患者总生存期的独立风险因素(P<0.001)。结论:HNRNPA2B1与乳腺癌发生发展密切相关,可以作为乳腺癌诊断及判断预后的标志物。

Nanopore测序揭示m6A修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的研究N6-甲基腺苷(m6A)修饰在中晚期头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的作用和基因相关通路,为头颈部HNSCC患者的个体化精准治疗提出新的观点及研究参考。方法选取3对临床中晚期HNSCC患者的癌及其癌旁组织(6个样本)进行测序,从癌和癌旁组织的转录组、m6A相关差异基因中筛选出两者共同的差异基因,通过基因本体(GO)分析、pathway分析及蛋白相互作用(PPI)分析,找出其中的枢纽(hub)基因,随后对网络中的基因进行基因集变异分析(GSVA),从而得到m6A修饰影响的基因及通路。结果从癌与癌旁组织的差异基因中筛选出96个转录组m6A相关的上调基因、159个m6A相关下调基因;信号通路分析发现PPAR通路、免疫相关通路下调,代谢通路上调;构建PPI后发现,CDK1呈现上调趋势,而DCN及ARG2均呈现下调趋势;GSVA分析发现PI3K/AKT信号通路在癌组织中上调;PPI中的hub基因共表达分析发现AGR2和CDK1在m6A调控下,与铁死亡相关基因联系很密切。结论m6A修饰与FOXA1、RPL8、DNC、CDK1、ApoE、POSTN、YWHAZ、MMP13等铁死亡相关基因紧密相关,m6A修饰可能通过铁死亡相关基因影响免疫、代谢相关通路,从而在中晚期HNSCC中起重要作用。

高速逆流色谱分离制备蛹虫草中虫草素和N^6-(2-羟乙基)-腺苷

采用高速逆流色谱(HSCCC)技术从蛹虫草子实体粗提物中分离制备高纯度虫草素和N6-(2-羟乙基)-腺苷。利用高效液相色谱(HPLC)测定目标产物在溶剂体系中的分配系数,优化HSCCC分离虫草素和N6-(2-羟乙基)-腺苷的溶剂体系,确定了以乙酸乙酯-正丁醇-1.5%氨水(1:4:5,V/V/V)为HSCCC的两相溶剂体系,并运用此溶剂体系,上相为固定相,下相为流动相,主机转速850r/min,流动相流速为1.5m L/min,检测波长为254nm条件下进行分离制备,在250min内从200mg蛹虫草子实体粗提物中一步分离得到10.8mg纯度99%的虫草素和6.1mg纯度98%的N6-(2-羟乙基)-腺苷。该方法简便、快速,为虫草素和N6-(2-羟乙基)-腺苷的大量制备建立了基础。

蛹虫草中N_6-(2-羟乙基)腺苷的提取分离及对小鼠睡眠的影响

目的:探讨蛹虫草中N6-(2-羟乙基)腺苷对小鼠睡眠的影响。方法:蛹虫草子实体通过溶剂提取和色谱分离得到N6-(2-羟乙基)腺苷。N6-(2-羟乙基)腺苷通过小鼠自发活动实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验观察其对小鼠睡眠的影响。结果:N6-(2-羟乙基)腺苷可减少正常小鼠机体的自主活动性;与正常对照组比,N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组能显著性延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间(P<0.01);中、高剂量组能显著增加戊巴比妥钠睡眠持续时间(P<0.05,P<0.01)和缩短小鼠戊巴比妥钠睡眠潜伏期(P<0.05)。结论:蛹虫草中N6-(2-羟乙基)腺苷具有明显的镇静、催眠作用,可有效地改善睡眠质量。

粉被虫草静置发酵产N^6-(2-羟乙基)腺苷培养基组分及前体物的筛选

在静置培养条件下,对粉被虫草cp菌株产N6‐(2‐羟乙基)腺苷(简称HEA)的培养基及其组分进行优化。采用单因素实验方法,以HPLC法对cp菌丝体中HEA进行检测,以HEA的产量为指标,结果表明查氏培养基有利于cp菌株产HEA,其产量是沙氏和PD培养基的3.7倍和4.48倍。以查氏培养基为基础培养基,进行碳、氮源的筛选中,最有利于cp菌株产HEA的是蔗糖和硝酸钠;在无机盐的筛选中,K2HPO4是促进cp菌株累积HEA最主要的无机盐,其HEA产量较CK增长了5 822.37%(提高了58.2倍);在查氏培养基上添加不同前体物和氨基酸,发现其结构类似物腺苷、次黄嘌呤和腺嘌呤都有促进cp菌株累积HEA的能力,其中腺苷和次黄嘌呤能提高其产量60%以上;而组氨酸是最有利于cp菌株累积HEA的氨基酸,产量达到(45.56±2.8)mg/L,较CK提高HEA产量251.68%,其次是L‐谷氨酸增产184.19%。

不同培养条件对粉被虫草产N6-(2-羟乙基)腺苷的影响

N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-Adenosine,HEA],又名茧草菌素,是一种钙离子拮抗剂,具有抗紫外辐射、抗血小板凝结和镇痛等效用,是集医药保健、化妆品等多项开发潜力于一身的生物资源,也是衡量虫草制品质量的一个重要生物活性物质指标。该研究采用高效液相色谱法对菌丝体中HEA进行检测,以HEA的产量为指标,考察不同培养方法、培养基及其组分、前体物和氨基酸对粉被虫草(Cordyceps pruinosaPetch)cp菌株产HEA的影响。结果表明:在沙氏培养基上,静置培养120 d,cp菌株HEA的产量明显优于摇床培养20 d和发酵罐培养3 d的产量,说明随培养时间的延长,cp菌株中HEA的累积会逐步增加。在静置培养条件下,cp菌株在查氏培养基上HEA的产量明显优于沙氏培养基和PD培养基,HEA的产量是沙氏培养基的3.7倍,是PD培养基的4.48倍。以查氏培养基为基础培养基,静置培养120 d进行碳、氮源的筛选中,最有利于cp菌株产HEA的是蔗糖和硝酸钠;在无机盐的筛选中,K2HPO4是促进cp菌株累积HEA最主要的无机盐,其HEA产量较对照(不添加无机盐的查氏培养基)提高了58.2倍;在查氏培养基上添加不同前体物和氨基酸,发现其结构类似物腺苷、次黄嘌呤和腺嘌呤都有促进cp菌株累积HEA的能力,其中腺苷和次黄嘌呤的效果最好,能提高HEA产量60%以上;添加的14种氨基酸中有组氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、亮氨酸、L-丙氨酸、赖氨酸和精氨酸等9种氨基酸能促进cp菌株产HEA的能力,其中组氨酸是最有利于cp菌株累积HEA的氨基酸,其HEA产量较ck(查氏培养基)提高251.68%,HEA产量达到(45.56±2.8)mg/L,菌丝体中HEA含量达到(4 633.10±65.65)μg/g。

老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1、E2F8蛋白表达变化及与预后的关系

目的 探讨N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)、E2F8转录因子8(E2F8)蛋白表达与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系。方法 选取46例老年乳腺癌患者,术中取癌组织和癌旁组织,用免疫组化染色法检测组织中YTHDF1、E2F8蛋白表达。随访患者并记录随访期间肿瘤复发、转移及死亡时间。用Spearman秩相关分析乳腺癌组织YTHDF1与E2F8蛋白表达的相关性;Kaplan-Meier法分析YTHDF1、E2F8蛋白表达与患者无进展生存预后的关系;Cox回归分析老年乳腺癌患者无进展生存预后的影响因素。结果 乳腺癌组织中YTHDF1、E2F8蛋白阳性表达率高于癌旁组织(P均<0.05),二者蛋白表达呈正相关(r=0.706,P<0.05)。TNM分期Ⅱ期、肿瘤最大径>2 cm、合并淋巴结转移老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1、E2F8蛋白阳性表达率高于TNM分期Ⅰ期、肿瘤最大径≤2 cm、无淋巴结转移的癌组织(P均<0.05)。32例患者发生肿瘤进展,YTHDF1、E2F8蛋白表达阳性患者5年无进展生存率低于其蛋白表达阴性患者(P均<0.05)。TNM分期Ⅱ期、合并淋巴结转移、YTHDF1蛋白阳性表达、E2F8蛋白阳性表达是老年乳腺癌患者无进展生存预后的独立危险因素(P均<0.05)。结论 老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1、E2F8蛋白高表达,且与老年乳腺癌患者肿瘤TNM分期、肿瘤最大径、淋巴结转移有关,是患者无进展生存预后的独立危险因素。

METTL3通过IGF2BP2依赖性方式参与m6A修饰调控HBV复制的机制

目的探究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2,IGF2BP2)协助甲基转移酶样3(methytransferase like 3,METTL3)通过N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰调控HBV复制的分子机制。方法以HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15及其亲本细胞HepG2为模型,斑点杂交分析m6A修饰水平,RT-qPCR和Western blot检测METTL3、IGF2BP2表达。生物信息学及免疫共沉淀分析METTL3与m6A阅读蛋白及其相互作用。将METTL3质粒、METTL3 siRNA和(或)IGF2BP2 siRNA转染至HepG2.2.15细胞,分别记为OE-METTL3、si-METTL3、si-IGF2BP2、OE-METTL3+si-IGF2BP2、si-METTL3+si-IGF2BP2、Control组;qPCR检测HBV DNA、HBV rcDNA、HBV cccDNA拷贝数,RT-qPCR或Western blot检测HBV pgRNA、METTL3、IGF2BP2表达。结果与HepG2细胞相比,在HepG2.2.15细胞中m6A修饰富集,METTL3、IGF2BP2表达水平升高(P<0.05)。与Control组相比,在OE-METTL3组中m6A修饰富集增强,IGF2BP2表达水平升高(P<0.05),HBV复制相关指标(HBV DNA、HBV rcDNA、HBV cccDNA、HBV pgRNA)升高(P<0.01);在si-METTL3组中则相反。生物信息学分析及免疫共沉淀显示METTL3与IGF2BP2为互作蛋白。与Control组相比,在si-IGF2BP2组中m6A修饰富集减弱,METTL3表达水平降低(P<0.01),HBV复制相关指标降低(P<0.01)。在OE-METTL3+si-IGF2BP2组中,HBV复制相关指标较OE-METTL3组降低(P<0.001)。在si-METTL3+si-IGF2BP2组中,HBV复制相关指标较si-METTL3组、si-IGF2BP2组降低(P<0.05)。结论METTL3依赖IGF2BP2富集m6A通过增强HBV rcDNA转化为cccDNA,进而增强pgRNA逆转录复制病毒。

IGF_(2)BP_(1)调控lncRNA NEAT1在类风湿关节炎中的作用

目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的全身性自身免疫疾病,可能导致关节变形和功能障碍。本研究旨在探索胰岛素样生长因子-2 mRNA结合蛋白1(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1,IGF_(2)BP_(1))在RA中的表达水平,以及其对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)核丰富转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)稳定性的影响和在RA发病机制中的作用。方法:通过GEO(Gene Expression Omnibus)数据库获取RA数据集,并将其分为正常对照组和RA组,使用R软件分析获取N^(6)-甲基腺苷(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)相关的甲基化酶的表达量并进行差异分析。分析差异表达的m^(6)A甲基化酶与lncRNA NEAT1的相关性。通过在线网站ENCORI预测与lncRNA NEAT1结合的蛋白质,并与lncRNA NEAT1表达相关的m^(6)A甲基化酶取交集,从而获取关键基因。通过RNA蛋白质相互作用分析实验(RNA pull-down)验证在RA滑膜细胞中NEAT1与关键基因结合的情况。通过蛋白质印迹法验证关键基因在正常滑膜细胞和RA滑膜细胞中的表达水平。在RA滑膜细胞中转染关键基因的小干扰RNA,通过real-time RT-PCR检测NEAT1在滑膜细胞中的表达水平。结果:差异分析结果显示:与正常对照组相比,共有8个m^(6)A甲基化基因在RA组中存在差异表达,其中IGF_(2)BP_(1)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase 14,N^(6)-adenosine-methyltransferase subunit,MEEEL14)与lncRNA NEAT1存在相关性;ENCORI预测结果显示:共有23个蛋白质能够与lncRNA NEAT1结合,与NEAT1共表达m^(6)A甲基化酶取交集,获得NEAT1相关m^(6)A甲基化蛋白IGF_(2)BP_(1)。蛋白质印迹法显示:与正常对照组相比,RA组中IGF_(2)BP_(1)蛋白在RA滑膜细胞中表达升高(P<0.05);RNA pull-down结果显示IGF_(2)BP_(1)蛋白与NEAT1结合;real-time RT-PCR的结果表明:敲减IGF_(2)BP_(1)可显著降低NEAT1 mRNA表达水平(P<0.01)。结论:IGF_(2)BP_(1)可能通过稳定lncRNA NEAT1表达参与RA发病,调控IGF_(2)BP_(1)水平可能是一种新的治疗RA的方法。