新型H3N8亚型禽流感病毒SQ03株的分离鉴定与免疫原性评价

为研究我国H3N8亚型禽流感病毒(AIV)遗传变异情况,研究从江苏某商品蛋鸡群采集病料进行病原分离鉴定、血凝素(HA)基因遗传进化分析、SPF鸡回归试验,并采用分离病毒制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,评价其免疫原性。结果显示:分离病毒为新型H3N8亚型(AIV),命名为A/chicken/Suqian/SQ03/2022(H3N8),以下简称SQ03株;该分离株HA基因属于欧亚禽分支,HA蛋白的裂解位点为PEKQTR↓GLF,为低致病性AIV,与我国2021—2022年分离的鸡源H3N8亚型AIV同源性最高,核苷酸相似性为98.6%~99.5%,而与我国2005年分离的鸭源毒株核苷酸相似性仅为87.8%,并且HA基因发生了较大的遗传变异;SQ03株按照106.0 EID50/只滴鼻途径感染SPF鸡后第3天出现甩鼻、张口呼吸等临床症状,感染后第5天排毒率达到100%,剖检可观察到鼻甲和气管内有黏液渗出物、肾脏肿大等病变;SPF鸡免疫油乳剂灭活疫苗后14 d HI抗体效价几何平均值达到8.2 log2,免疫后21 d达到10.3 log2,可为免疫鸡提供针对H3N8亚型AIV的完全攻毒保护。研究表明,SQ03株为我国当前流行的新型H3N8亚型AIV,具有较强致病性和良好的免疫原性,可作为新型H3N8亚型禽流感灭活疫苗的效力检验用毒和疫苗候选株。

湖南省首例人感染H3N8亚型禽流感病例的病毒分离及分子进化分析

目的本研究从流感样病例样本中分离出湖南省首例人感染H3N8亚型AIV毒株,并对该毒株进行了分子进化分析,为人感染H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的防控提供实验室依据。方法通过实时荧光RT-PCR方法检测甲型流感病毒核酸、接种MDCK细胞进行病毒培养并通过血凝试验进行初步鉴定,继而对分离到的AIV进行高通量二代基因测序,并将测序结果进行相似性比较、基因特征和进化分析。结果鉴定出人感染H3N8亚型AIV分离株(A/Changsha/1000/2022(H3N8),相似性分析显示HA和NA基因序列与来自河南省的人感染AIV株A/Henan/4-10CNIC/2022(H3N8)相似性最高,6个内部基因(MP、NS、PB1、PB2、NP、PA)均来源于H9N2亚型AIV。HA蛋白裂解位点为PEKQTR/GLF,未出现连续重复碱性氨基酸,符合低致病性AIV的特征,NA基因出现了耐药位点I312V突变,可能对奥司他韦有耐药性改变。PB2基因出现E627V宿主适应性突变,M2蛋白出现S31N金刚烷胺耐药性位点突变。分子进化显示HA基因属于欧亚分支,NA基因属于北美分支,NS、PB2、MP和PB1基因与湖南省内来源的H9N2毒株亲缘关系密切。结论此次新发现的人源A/Changsha/1000/2022(H3N8)毒株所有基因片段均来源于禽类,属于新型重组低致病性AIV,有可能突破物种屏障发生禽到人之间的传播,建议完善流感/AIV监测网络系统,增加对H3亚型AIV的监测。

1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒遗传演化分析

为分析1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化特征,对2021年从北京圆明园遗址公园送检的黑天鹅样品中鉴定出的1株H5N8亚型禽流感病毒(A/Wild swan/China/Beijing0201/2021)的全基因组进行扩增、克隆与序列测序,并应用分子生物学软件对其进行遗传演化及关键氨基酸位点分析。结果显示,该H5N8亚型禽流感病毒株属于clade2.3.4.4b进化分支,其PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、MP、NS基因均与H5N8亚型AIV的相应基因片段具有较高同源性,且与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、俄罗斯、柬埔寨、法国等地的H5N8毒株密切相关。氨基酸位点分析显示,该毒株HA蛋白裂解位点呈现高致病性禽流感病毒的分子特征,且出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型禽流感病毒对人源唾液酸受体结合的能力;该毒株的PB2蛋白、NP蛋白、M1蛋白和NS1蛋白均存在多个可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性的关键氨基酸位点。研究结果可为H5N8亚型禽流感病毒的进化规律研究及综合防控提供参考。

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(简称DK/NJ/1102)进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接p GEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用Gen Bank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与Gene Bank中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为"P-E-K-A-S-R-G",符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒NS基因的分子克隆及序列分析

根据GeneBank上已发表的H3N8亚型禽流感的非结构蛋白基因(NS)序列,设计了一对特异性引物,成功地从A/mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)中克隆到NS基因序列,该克隆基因全长860bp,编码NS1和NS2两种非结构蛋白。与其他H3N8亚型的NS基因进行了同源性比较,核苷酸同源性为65.5%～98.3%,推导的氨基酸序列同源性为65.4%～97.8%。NS基因遗传进化树形成两个分支,该分离株处于等位基因B组。另外,此毒株NS基因在263～277位没有发生15个碱基的缺失。A/mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)株149位为丙氨酸,其不能感染哺乳动物。

应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒

为建立马流感病毒(EIV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型EIV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应,而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性。该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术。

广西H3N8亚型马流感病毒耐药性分析

【目的】了解广西H3N8亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)对抗流感病毒药物的耐药性,为临床科学用药提供参考。【方法】采用RT-PCR对广西H3N8亚型EIV分离株A/Equine/Guangxi/1/09(简称GX09株)进行M基因和NA基因扩增,测序分析M2基因和NA基因特征及其与耐药性相关的氨基酸位点,并进行生物学耐药性试验。【结果】GX09株M2基因的相关耐药性位点(L26F、V27A、A30T、S31N、G34E)均未发生变异;在NA基因相关耐药性位点方面,也仅在S247A位点处出现氨基酸替换,其他位点均较保守,未出现氨基酸替换。生物学耐药性试验结果表明,GX09株对金刚烷胺敏感,对奥司他韦已产生耐药性。【结论】广西目前流行的EIV对金刚烷胺敏感,在流感易发季节仍可选用烷胺类药物对广西地区的马流感进行预防和治疗。

两株H6N8亚型禽流感病毒分离株的分离与鉴定

为了解禽流感病毒(AIV)在我国华南地区的流行情况,我们对活禽市场中分离得到的两株鸭源H6N8亚型AIV[A/duck/Fujian/S2191/2011(H6N8)(FJ/191/11)和A/duck/Guizhou/S4035/2011(H6N8)(GZ/035/11)]进行全基因序列测定,并进行其对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验。序列分析显示:HA裂解位点基序为339PQIETR↓GLFG348,为低致病性AIV特征。内部基因分别源于两个国内流行的H6亚型病毒家系(ST339-like和HuN573-like)。序列分析表明FJ/191/11和GZ/035/11为H6亚型病毒与其他亚型AIV的N8NA基因发生重组,呈现明显的异源性。两分离株的感染性试验显示,它们对鸡和小鼠均呈低致病性;而且不能在鸡体内有效复制;对小鼠的感染性实验结果显示,小鼠肺脏和鼻甲病毒分离结果为阳性,其他脏器病毒滴定结果为阴性。

3株H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡和Balb/c小鼠致病性研究

为了解从洞庭湖区鸭子和环境中分离的3株H3N8亚型禽流感病毒的致病性。利用这3株毒株对SPF鸡及Balb／c小鼠进行致病性试验，结果显示，3株毒株均能使鸡感染并排毒，但不引起鸡明显的临床症状及死亡，感染鸡后第3天～第7天在泄殖腔排出高滴度病毒，且持续至第11天（仅观察到该天），与以往的研究相比，排毒时间更长。3株H3N8亚型毒株感染小鼠后，能在小鼠鼻甲及肺脏内高滴度复制，但小鼠的体重变化不明显。结果说明3株H3亚型AIV对家禽及哺乳动物感染能力增强，因此加强该亚型的流行病学监测及致病性的研究非常重要。

H3N8亚型马流感病毒HA1基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增的HA1基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,测序正确后转化入Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约53ku,以沉淀性形式存在的重组蛋白,且在37℃,0.4mmol/L IPTG条件下诱导8h表达效果最好。表达产物经切胶纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,表达的蛋白与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。

H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以灭活马流感病毒(EIV)A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经常规细胞融合后,用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA方法筛选获得3株(3C2、5G10和5A10)能稳定分泌H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。其中3C2和5G10为IgG2α,5A10为IgM亚类,腹水抗体效价检测显示,3C2和5G10为1∶64 000,5A10为1∶32 000。HI和Western blot结果表明,3株单克隆抗体均为EIV血凝素特异性单克隆抗体。特异性试验结果表明,所获得的mAb不与H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒(EAV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马日本脑炎病毒(JEV)发生交叉反应。研究为建立单克隆抗体介导的检测马流感病毒抗原和抗体的血清学方法以及为实现马流感标准化诊断奠定基础。

陕西省一起野禽H5N8亚型高致病性禽流感疫情紧急流行病学调查

2021年6月9日,陕西省神木市红碱淖国家级自然保护区发生一起野禽H5N8亚型高致病性禽流感疫情。为了解该起疫情的发生经过、可能来源、内部传播方式以及对外扩散风险,组织开展了流行病学调查。现场调查发现:5月27日该保护区的黑颈䴙䴘种群开始发病死亡,28日保护区工作人员发现后上报疫情,经国家禽流感参考实验室确诊为H5N8亚型高致病性禽流感疫情;截至6月26日,累计死亡黑颈䴙䴘5486只,未见其他鸟类及周边家禽异常死亡。采样检测发现,野禽环境中病毒污染面较小,家禽中未检出病原,家禽H5亚型禽流感免疫抗体水平较高。调查认为:疫情由迁徙候鸟感染禽流感病毒传入引起,发病局限于野禽;因红碱淖水质碱性较强,病毒存活时间较短,疫情经湖水传播的风险性较小。疫情确诊前,保护区已采取了无害化处理病死禽、消毒、人车管控等措施,当地农业农村部门对周边家禽开展了禽流感紧急疫情排查和强化免疫。因此,结合现场调查和实验室检测结果,推断疫情由野禽向家禽扩散风险很低。本次疫情提示,应多部门密切协作,持续做好高致病性禽流感疫情监测工作,做到疫情早发现,果断处置,以降低疫情扩散风险。

H3N8亚型马流感病毒拯救体系的建立

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株的EIVrH3N8,生物学试验结果表明,rH3N8在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。以猪流感病毒(SIV)A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)内部基因的重组阳性质粒替换rH3N8的相应基因,成功拯救出重组病毒rgH3N8。两拯救毒株经鸡胚一次传代的血凝效价分别为1∶32、1∶64,最高可达1∶1024、1∶2048;接种MDCK细胞54h后的血凝效价最高均可达1∶512。rH3N8亚型EIV的成功拯救及基因的成功替换,为流感病毒突破种间屏障分子机制的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

H3N8亚型EIV HA基因在昆虫细胞中的表达及生物学特性分析

为表达H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA蛋白,本研究将A/equine/xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中,构建重组转移质粒pFB-XJ3-HA,并将其转化至DH10BAC感受态细胞中,与杆状病毒骨架质粒Bacmid进行重组,重组杆粒rBac-XJ3-HA转染Sf9昆虫细胞,构建重组杆状病毒rBv-XJ3-HA,并通过细胞免疫组化和western blot进行鉴定。结果表明rBv-XJ3-HA构建正确,表达的HA蛋白与抗EIV的血清反应良好;血凝试验结果表明表达的HA蛋白具有良好的血凝活性。本研究为研制EIV HA蛋白亚单位疫苗提供了实验依据。

新疆南疆驴源H3N8亚型EIV NA基因序列分析

【目的】明确新疆南疆驴是否感染EIV，及EIV NA基因特征。【方法】根据GenBank登录的EIV基因序列，设计合成1对引物，针对新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺进行EIV NA基因RT-PCR扩增、电泳分析、胶回收、测序及序列分析。【结果】中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015（H3N8）株NA基因长1 413 bp，编码470个氨基酸。与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸同源性为752%~996%，与国内外参考毒株氨基酸同源性为80%~100%，与国内毒株、哈萨克斯坦毒株和印度毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一一个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007（H3N8）糖基化位点个数和分布位置完全一致。【结论】新疆南疆存在驴感染EIV，可能为国内疫情的延续或周边国家传入。

新疆南疆驴源H3N8亚型EIVHA基因序列分析

为明确新疆南疆驴是否感染马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)及驴源EIV HA基因特征,根据GenBank登录的EIV基因序列,设计合成1对引物,采集新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺组织样品,采用RT-PCR扩增驴源EIV HA基因片段,并对扩增产物进行测序与序列分析。结果表明,中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA基因长1 704bp,编码567个氨基酸。同源性分析结果显示,与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为88.9%~99.9%和88.3%~99.8%,与国内毒株和哈萨克斯坦毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一1个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的比对结果显示,2个毒株裂解位点、糖基化位点、抗原位点和受体结合位点氨基酸完全一致,只是错位2个氨基酸。确定新疆南疆存在驴感染EIV,可能为国内疫情的延续或周边国家传入。

马流感病毒(H3N8亚型,Huabei株)对马的致病性研究

为研究从华北地区分离的H3N8亚型马流感病毒（Huabei株）对马的致病性,分别用E2、E3、E4、E5及E10代病毒液人工感染健康马,比较了不同代次毒株对马的致病性差异.研究表明,E2、E3代病毒以10^7.2～ 10^7.4EID50剂量经喷雾途径可使12 ～ 18个月龄的马出现持续性发热、咳嗽和流浆液性鼻液等典型马流感症状;同样剂量的E4、E5和E10代病毒感染马匹后仅表现为流浆液性鼻液.本研究确定了马流感病毒Huabei株的感染剂量及代次,为马流感灭活疫苗效果评价奠定了实验感染模型基础.

禽流感病毒H3N8亚型野鸭源分离株基因特征

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成12对特异引物,通过反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出分离于野鸭(Mallard)的1株H3N8亚型禽流感病毒的全基因片段,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为PB2/2280、PB1/2276、PA/2150、HA/1734、NP/1497、NA/1413、MP/759、NS/838bp核苷酸,分别编码759、758、716、577、498、4702、52/962、30/125个氨基酸。A/mallard/Sanjiang/359/2007(H3N8)株HA有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点序列为PEKQTR↓GLF,无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。根据A/mal-lard/Sanjiang/359/2007(H3N8)株与参考毒株的序列比较分析结果推测,该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。

高通量测序一株天鹅源H5N8亚型流感病毒遗传演化分析

为研究一株天鹅源H5N8亚型禽流感病毒(AIV)的遗传演化规律,本研究对2016年从山西省疾控中心送检天鹅样品中分离到的一株H5N8亚型流感病毒(A/swan/Shanxi/6/2016)的全基因组序列进行高通量测序及遗传演化分析。结果显示,分离的病毒为Clade 2.3.4.4分支高致病禽流感病毒(HPAIV);BLAST分析显示该分离株的NP基因与H3N8亚型AIV的NP基因具有较高同源性,而其它基因节段则分别与来自其它国家的H5N8亚型AIV的相应基因节段同源性较高,进一步选取与各基因节段核苷酸同源性较高的病毒株作参考序列构建其系统进化树,推测该分离株为一株重组病毒株。特殊氨基酸位点分析显示,其具有典型的禽型受体结合位点和典型的人型受体结合位点。并且M1蛋白、NS1蛋白和PB2蛋白具有H5N1亚型AIV对鼠致病性增强的分子标志,提示该株野鸟源流感病毒可能具备感染哺乳动物的能力。本研究对H5N8亚型AIV的综合防控具有一定的指导意义。

一株鸽源H10N8亚型禽流感病毒的遗传进化分析及小鼠感染特性的研究

为了解从江苏某活禽市场分离鉴定出的一株鸽源H10N8亚型禽流感病毒(AIV)A/pigeon/Jiangsu/JYP090602/2019株的生物学特性,本研究对该分离株进行空斑纯化和全基因组测序,并以10^(6) EID_(50)病毒感染BALB/c小鼠进行致病性研究。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点为334PEIMQGR↓GLF^(343),只含有一个碱性氨基酸,为低致病性AIV的分子特征。其HA基因与A/chicken/Zhejiang/102622/2016(H10N8)株HA基因的同源性达98.7%,NA基因与A/pigeon/Longquan/LQ67/2016(H2N8)株NA基因的同源性达96.5%,内部基因PB2、PB1、PA、M、NP和NS分别与H7N3、H1N9、H10N7、H1N2、H7N3和H11N3亚型AIV相应基因的同源性最高,具有遗传多样性。小鼠感染试验结果显示,该病毒仅引起小鼠体质量轻微变化,但能够在小鼠的肺脏和心脏中复制,肺脏病毒滴度为4.74 lg EID_(50)/mL,且可引起肺部组织病变。上述结果表明该病毒株为新型重组病毒,对小鼠具有一定致病性,本研究为H10亚型禽流感的预警和防控提供一定的参考依据。