水牛NAAA基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（N-acylethanolamine acid amidase，NAAA）基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制，本试验采用了3＇Race、生物信息学分析、载体构建和细胞转染等技术对NAAA进行了研究。结果表明：水牛NAAA基因的编码区全长1 071 bp，共编码356个氨基酸；多重序列比较分析显示：水牛NAAA核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、猪、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、96%、95%、87%、87%、85%和84%，结合系统进化树分析结果，NAAA基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对NAAA蛋白质的分析表明：该蛋白呈弱酸性，第26～27位氨基酸为其信号肽，细胞亚定位于溶酶体，存在NAAA-beta和Ntn_AC_NAAA结构域。成功构建水牛NAAA基因真核表达载体，转染293 T后，能够正确形成NAAA-EGFP融合蛋白，产生绿色荧光信号。研究结果为阐明NAAA基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。

孪尾疏水缔合共聚物P(AM/NaAA/DiC_6AM)盐水溶液在中高温下的粘度

在十二烷基硫酸钠 (SDS)存在下进行胶束聚合 ,采用先加碱共聚后水解的方式 ,改变表面活性剂、疏水单体摩尔比 (SMR) ,疏水单体摩尔分数为 0 .372 % ,由丙烯酰胺 (AM )、N ,N 二己基丙烯酰胺 (DiC6AM )合成了孪尾型疏水缔合三元共聚物P(AM/NaAA/DiC6AM) ,理论水解度 15 %。介绍了合成过程。考察了不同SMR(12 .5 0～ 10 0 .0 )下得到的共聚物水溶液 85℃ ,7.34s-1下的 (表观 )粘度 ,共聚物浓度一般为 2 .0 g/L。共聚物的水溶性随SMR的增大而改善 ,SMR≥ 13.36时溶于标准盐水 (含Ca2 + 、Mg2 + 、HCO-3 ,矿化度 19334mg/L) ;疏水单元平均序列长度NH 和Huggins常数KH 随SMR增大而减小 ,SMR =10 0 .0时KH 趋近HPAM的值。浓度 0 .5～ 5 .5 g/L范围的共聚物标准盐水溶液粘度曲线 ,随SMR增大移向高浓度低粘度方向。随NaCl浓度 (2 0～ 2 0 0g/L)或CaCl2 浓度 (2～ 10 g/L)增大 ,共聚物水溶液粘度先降低 ,后升高 ,出现增粘效应 ,SMR越小 ,增粘效应越强。外加SDS在一定浓度范围对共聚物标准盐水溶液产生增粘效应 ,SMR越小 ,增粘效应越强。共聚物标准溶液粘度在 35～ 80℃范围随温度升高而降低 ,在 0～ 12 2s-1范围随剪切速率增大而降低。对实验结果作了解释。图 6表 2参 10。

大鼠椎间盘累积损伤性炎症反应中大麻素水解酶——FAAH、NAAA表达及意义的初步研究

本研究试图通过检测大麻素(CB)的两种主要水解酶——N-乙酰基乙醇胺水解酸性酰胺酶(NAAA)、脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)在鼠累积损伤性椎间盘炎症反应过程中的表达来初步揭示其中大麻素的参与过程及作用机制。方法清洁级Wistar大鼠随即分成实验组与对照组,根据Jill A.Ulrich制作方法准备实验组,以切皮后即缝合为对照组,在术后第3、7、10天,实验组与对照组每次各取6只,取出相应椎间盘,进行形态学观察,应用Real Time-PCR技术检测FAAH、NAAA的表达水平。结果与对照组相比,实验10d组可见刺伤所致纤维环断裂,髓核内出血。在椎间盘累积性损伤7d时,NAAA和FAAH表达含量分别约为对照组的3倍,并形成高峰;而在损伤10d后,其表达量呈减少趋势。结论作为水解酶的底物CB类物质在第7天时候表达含量呈低谷,而随着时间的延长逐渐增高。CB类物质参与了炎症反应的发展过程,从而抑制骨骼椎间盘的退变。

疏水改性AM/NaAA/C_(16)DMAAC共聚物的合成

采用氧化还原体系，以十六烷基二甲基烯丙基氯化铵（C16DMAAC）、丙烯酸钠（NaAA）、丙烯酰胺（AM）为原料，合成了AM／NaAA／C16DMAAC共聚物。考察了合成条件对共聚物特性粘数和单体转化率的影响，确定了最佳合成条件：引发剂加量0．3％-0．5％，其中n（亚硫酸氢钠）：n（过硫酸铵）=1：2；单体加量10％，其中n（AM）：，n（NaAA）：n（C16DMAAC）=84．7：15．0：0．3；反应温度45—50℃；反应时间4h；疏水单体摩尔分数0．3％。用红外光谱对产物进行表征，表明其符合理论上的结构，为目标产物。

大麻素在鼠累积损伤性椎间盘慢性炎症反应中的表达及意义的初步研究

目的本研究试图通过检测大麻素(CB)的两种主要水解酶——N-乙酰基乙醇胺水解酸性酰胺酶(NAAA)、脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)以及大麻素1、2型受体(CB-1R、CB-2R)在鼠累积损伤性椎间盘慢性炎症反应过程中的表达来探讨其中大麻素的参与过程及作用机制。方法清洁级Wistar大鼠随即分成实验组与对照组,根据Ulrich制作方法准备实验组,以切皮后即缝合为对照组,在术后第3、7、10天,实验组与对照组每次各取6只,取出相应椎间盘,进行形态学观察,应用Real Time-PCR技术检测FAAH、NAAA、CB-1R、CB-2R的表达水平;利用Western blot方法检测CB-2R蛋白含量。结果与对照组相比,实验10 d组可见刺伤所致纤维环断裂,髓核内出血。在椎间盘累积性损伤7 d时,NAAA和FAAH表达含量分别约为对照组的3倍,并形成高峰;而在损伤10 d后,其表达量呈减少趋势。3、7、10 d组CB-2R蛋白表达与对照组相比明显增高(P<0.01)。结论作为水解酶的底物CB类物质在第7天时候表达含量呈低谷,而随着时间的延长逐渐增高。CB受体表达在损伤后显著增高证明CB类物质慢性炎症反应阶段的调节作用越来越大。

独活挥发油对N-脂肪酰基乙醇胺水解酶的抑制作用及抗炎作用研究

目的:研究独活挥发油对内源性大麻素水解酶N-脂肪酰基乙醇胺水解酶(N-acylethanolamine-hydrolyzing acidamidase,NAAA)水解活性的影响以及对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应模型的抗炎作用。方法:采用水蒸气蒸馏法提取独活挥发油,GC-MS检测化学成分;采用LC-MS检测NAAA水解活性;采用LPS诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症反应模型;采用LC-MS检测细胞内棕榈酸乙醇胺(N-palmitoylethanolamine,PEA)水平;采用实时定量PCR检测肿瘤坏子因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素-6(IL-6)mRNA表达;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α含量;采用Griess法检测一氧化氮(NO)含量。结果:独活挥发油可抑制NAAA水解活性,升高LPS诱导的RAW264.7细胞内PEA水平;独活挥发油可下调LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α,iNOS,IL-6 mRNA表达;独活挥发油可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α和NO释放。结论:独活挥发油能够抑制NAAA水解活性,升高细胞内PEA水平,降低炎症因子表达,具有一定的抗炎作用。