枇杷果实中NAD-MDH基因克隆及植物表达载体构建

为探索枇杷果实中苹果酸的积累与降解机制,从枇杷果实转录组中得到NAD-MDH的开放阅读框的基因序列。以枇杷高酸品种解放钟和低酸品种白梨为材料,提取果实中总RNA,运用RT-PCR技术克隆出枇杷果实中苹果酸合成酶基因NAD-MDH,并进行荧光定量PCR分析。结果表明:枇杷果实中苹果酸合成酶基因NAD-MDH的开放阅读框(ORF)为996 bp,共编码了332个氨基酸。经荧光定量PCR分析,解放钟和白梨在花期后95 d时NAD-MDH基因表达量最高;花后80~105 d,NAD-MDH基因在高酸与低酸品种间存在显著差异。采用无缝克隆技术成功构建了植物表达载体EjNAD-MDH-PBI121,并导入根瘤农杆菌EHA105中得到植物转化工程菌,为后期利用转基因技术改良枇杷果实品质及遗传改良打下基础。

几种沙生植物光合碳代谢途径关键酶的研究

研究了分布于甘肃省临泽地区的沙拐枣、珍珠、霸王、泡泡刺、胡杨等５种沙生植物的光合酶：果糖－１．６－双磷酸酯酶（ＦＤＰａｓｅ）、１．５－二磷酸核酮糖羧化酶（ＲＵＢＰｃａｓｅ）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰｃａｓｅ）、ＮＡＤ－苹果酸脱氢酶（ＮＡＤ－ＭＤＨ）活性的季节变化。结果表明，珍珠和沙拐枣的ＦＤＰａｓｅ酶活性远低于其它几种材料；珍珠、霸王、沙拐枣的ＰＥＰｃａｓｅ活性明显高于其它两种材料；珍珠、沙拐枣的ＮＡＤ－ＭＤＨ活性明显高于其它三种材料。可见，珍珠、霸王是ＣＡＭ植物，沙拐枣是Ｃ４植物，胡杨是Ｃ３植物，泡泡刺有可能在干旱协迫下由Ｃ３向Ｃ４或ＣＡＭ途径转化。

‘蜂糖李’果实发育过程中有机酸含量变化及其与苹果酸代谢相关酶的关系

【目的】明确‘蜂糖李’果实有机酸组成与含量特点,揭示其发育过程中有机酸含量的变化规律及其与苹果酸代谢相关酶的关系,阐明有机酸积累的关键时期和关键酶。【方法】以‘蜂糖李’及对照‘四月李’为材料,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatograph,HPLC)分析测试李果实发育过程中有机酸组分及含量,并测定苹果酸代谢相关酶的活性。【结果】利用高效液相色谱分析李果实中有机酸组分及含量,发现‘蜂糖李’果实成熟时总酸含量(ω,后同)为5.94 mg·g-1,包括苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、莽草酸和琥珀酸6种,其中以苹果酸含量最高(占总酸含量的88%),‘四月李’果实中有机酸组分与‘蜂糖李’一致,均属于苹果酸型。2个李品种果实中总酸含量的差异主要是由苹果酸含量的差异所致。通过分析李果实发育过程中有机酸含量的变化,发现‘蜂糖李’果实中苹果酸含量大量积累的关键时期在果实发育前期,整体呈先增加后降低的趋势,草酸、酒石酸含量逐渐降低,而柠檬酸含量逐渐升高。与‘四月李’相比,‘蜂糖李’果实中苹果酸、草酸、酒石酸及总酸含量的变化趋势与之一致,且苹果酸及总酸含量在整个过程中均显著低于‘四月李’,而柠檬酸含量的变化趋势与之相反。最后通过分析苹果酸含量与相关代谢酶活性之间的相关性,表明‘蜂糖李’果实中苹果酸在果实发育前期大量积累主要是该时期磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性增强促进了苹果酸的大量合成以及NADP-苹果酸酶(NADP-ME)活性降低减少苹果酸的分解,与NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)关系不大,而‘四月李’苹果酸积累的关键酶是NAD-MDH。在果实发育后期,‘蜂糖李’及‘四月李’NADP-ME活性迅速升高,前者PEPC活性减弱,后者NAD-MDH活性下降,使得2者果实中苹果酸的降解大于合成而呈降低趋势。【结论】‘蜂糖李’是以苹果酸为主要有机酸的低酸型李品种,其果实中苹果酸积累的关键时期为果实发育前期,苹果酸含量的变化由PEPC和NADP-ME协同调控,而对照‘四月李’由NAD-MDH和NADP-ME起主要的调控作用。

不同中间砧对苹果果实苹果酸代谢关键酶活性及其相关基因表达的影响

为深入探究中间砧影响苹果果实苹果酸代谢的机理,以SH40实生后代（代号53、111和236）为中间砧嫁接的‘天红2号’苹果树为试材,测定果实发育过程中苹果酸含量、相关代谢酶活性及基因相对表达量。结果表明：果实成熟时,以53号为中间砧嫁接的‘天红2号’果实苹果酸含量显著高于以111号为中间砧的。盛花后30、40、100~160 d,以53号为中间砧的果实中苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性显著高于以111号为中间砧的;盛花后30、40和130 d,53号处理的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性显著高于111号处理的;盛花后100 d,以111号为中间砧的果实中苹果酸酶（NADP-ME）活性显著高于以53号为中间砧的。基因表达结果显示,盛花后100和160 d,以53号为中间砧的NAD-MDH基因相对表达量显著高于以111号为中间砧的,同时NADP-ME基因表达量也显著高于以111号为中间砧的;盛花后30和160 d,以53号为中间砧的PEPC基因相对表达量显著高于以111号为中间砧的。