过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度。【方法】将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata CCTCCM202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U/mg蛋白的重组菌T.glabrata-PDnoxE。【结果】与出发菌株T.glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕。补加50g/L葡萄糖继续发酵20h,则使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%。【结论】增加细胞内NAD+含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度。

Dynamic Non-Invasive Detection of NADH Based on Blood Flow-Mediated Skin Fluorescence (FMSF) Method

Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH/NAD+) is involved in important biochemical reactions in human metabolism, including participation in energy production by mitochondria. The changes in fluorescence intensity as a function of time in response to blocking and releasing of blood flow in a forearm are used as a measure of oxygen transport with blood to the tissue, which directly correlates with the skin microcirculation status. In this paper, a non-invasive dynamic monitoring system based on blood flow-mediated skin fluorescence (FMSF) technology is developed to monitor the NADH fluorescence intensity of skin tissue during the process of blocking reactive hyperemia. Simultaneously, laser speckle contrast imaging (LSCI) and laser Doppler flowmetry (LDF) were used to observe blood flow, blood oxygen saturation (SOt2) and relative amount of hemoglobin (rHb) during the measurement process, which helped to explore NADH dynamics relevant physiological changes. A variety of parameters have been derived to describe NADH fluorescence curve based on the FMSF device. The experimental results are conducive to understanding the NADH measurement and the physiological processes related to it, which help FMSF to be a great avenue for in vivo physiological, clinical and pharmacological research on mitochondrial metabolism.

高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NADH脱氢酶亚单位4、5表达的影响

目的 探讨高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC Ⅱ）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚单位4、5表达的影响.方法 原代培养Sprague-Dawley（SD）胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至接近汇合状态时随机分为高氧组和正常对照组,高氧组持续暴露于常压高浓度氧中（氧浓度〉90%.CO2浓度5%）,正常对照组仍置于5%CO2培养箱中,两组均继续分别培养6、12、24h;采用免疫细胞化学染色SP法检测NADH脱氢酶亚单位4（DN4）蛋白的表达.采取半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定ND4、NADH脱氢酶亚单位5（ND5）mRNA的表达.结果 （1）SP法结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达增强,12h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达减弱,但差异均无统计学意义（均P〉0.05）,24hAEC Ⅱ ND4蛋白的表达显著减弱（P〈0.05）;（2）RT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA表达增强,差异均无统计学意义（均P〉0.05）.12、24h AECⅡ ND4、ND5 mRNA表达显著减弱（P〈0.05）.结论 持续高氧下调胎鼠AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA和AEC Ⅱ ND4蛋白的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程.

NADH-细胞色素b_5还原酶在甲状腺过氧化氢生物合成中的作用

目的 探讨 NADH-细胞色素 b5还原酶 (b5R)在甲状腺过氧化氢生物合成中作用。 方法 应用高香草酸荧光分析技术及 NADH-高铁氰化钾还原酶法 ,对正常和格雷夫斯病甲状腺过氧化氢 (H2 O2 )和 b5R进行测定 ,同时观察 b5R抑制剂对 H2 O2 生成和蛋白结合碘形成的影响。 结果 格雷夫斯病甲状腺 b5R活性和 H2 O2 水平均明显高于正常 ,而 H2 O2 酶活性在两者间差异无显著性。加 b5R抑制剂对氯汞苯甲酸抑制 b5R活性 ,格雷夫斯病和正常甲状腺 b5R活性降低近 85 % ,同时 H2 O2 降低近 5 0 % ,蛋白结合碘形成减少近 5 2 %。 b5R活性和 H2 O2 水平两者呈显著正相关。 结论 b5R参与甲状腺内 H2 O2 的生物合成 ,是甲状腺内产生 H2 O2 的重要酶系。

调控NADH/NAD^+对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌中,L-丝氨酸由糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸经过3步反应生成,这个过程产生2个NADH,而L-丝氨酸的合成过程并不涉及NAD^+的生成,多余的NADH是否会影响菌株的生长及产L-丝氨酸?该研究通过外源添加NAD^+的前体物质烟酸,内源表达NADH氧化酶编码基因nox A,考察调控NADH/NAD^+对Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI生长和产L-丝氨酸的影响。结果表明,添加不同浓度烟酸,菌株的L-丝氨酸产量、生物量及糖耗较未添加时略有提高。而通过加强表达NADH氧化酶编码基因nox A,构建重组菌Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI-nox A,重组菌中NADH氧化酶比酶活是出发菌的11.6倍,L-丝氨酸产量达到28.93 g/L,较出发菌提高9.0%,糖酸转化率达到0.29 g/g蔗糖,较出发菌提高7.4%,OD562最大值为51.38,较出发菌提高6.6%,说明NADH氧化酶的过表达能够促进重组菌株的生长及碳源利用,提高菌株的L-丝氨酸产量。

益气活血中药复方对CVB3乳鼠心肌细胞感染模型NADH脱氢酶亚基1和2表达的影响

目的:研究益气活血中药复方对CVB乳鼠心肌细胞感染模型NADH脱氢酶亚基1和2表达的影响,以期从基因水平揭示益气活血中药复方治疗CVB3心肌炎的作用机制,进一步证实益气活血中药复方是治疗CVB3病毒性心肌炎的有效方剂。方法:通过改良的抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分离大鼠心肌细胞病毒组和益气活血中药复方给药组差异表达的基因,并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证。结果:SSH结果显示中药组中NADH脱氢酶亚基1和NADH脱氢酶亚基2基因的表达均比病毒组中低,这一结果通过荧光RT-PCR得到验证。结论:益气活血法能够通过调节NADH脱氢酶亚基1和2的表达而实现治疗病毒性心肌炎的目的。

甲酸脱氢酶用于辅酶NADH再生的研究进展

NADH依赖型氧化还原酶广泛应用于精细化学品和手性化合物的生物合成,其中辅酶NADH作为还原当量起着关键的作用,NADH的再生关系到生物氧化还原过程能否进行.甲酸脱氢酶在辅酶NADH再生中的应用是目前代谢工程领域研究的热点之一.本工作回顾了甲酸脱氢酶的来源和氨基酸序列、酶的理化性质和催化机理等方面的研究进展,从化学稳定性、热稳定性和成本等方面阐述了甲酸脱氢酶在辅酶再生系统中的应用,讨论了甲酸脱氢酶用于辅酶再生的代谢工程平台的发展趋势,并对研究发展方向提出了一些设想.

高效液相色谱法测定骨骼肌ATP、ADP、AMP、NAD^+、NADH含量

采用高效液相色谱法测定骨骼肌腺嘌呤核苷酸和辅酶Ⅰ含量。高压液相系 统包括：惠普公司ＺＯＢＡＸ－Ｃ１８反相柱５ｍｍ×１２ｃｍ，５９０ＵＶ检测器。流动相为２２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液，内含１０％甲醇，用四丁基氢氧化胺ＴＢＡＨ调ｐＨ至６５。等比洗脱，流速为０８ｍｌ／ｍｉｎ。检测波长为２５４ｎｍ。所有样品和标准品在进样前均用０４５μｍ孔径的虑膜过滤后进样５μｌ作色谱分析。结果表明：ＨＰＬＣ可以同时测定ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ，分离效率高，操作简便，快速每个样品仅需１５分钟，而且，重现性好，定性可靠，定量准确。

阿魏酸聚合修饰玻碳电极的制备及其对NADH的催化氧化

研究了阿魏酸修饰电极的制备、性质及对 NADH的电催化作用 .该电极在 0 .1 mol/L磷酸缓冲溶液( p H =6.60 )中 ,于 -0 .1～ +0 .5 0 V ( vs. Ag/Ag Cl)电位范围内呈现一对氧化还原峰 ,其式量电位 E0 为+0 .1 88V( vs.Ag/Ag Cl) ,且 E0 随 p H增加而负向移动 .电子转移系数为 0 .496,表观电极反应速率常数( ks)为 6.6s-1.电极反应的电子数为 1且有 1个质子参与 .该修饰电极对 NADH氧化具有很好的催化作用 .在 NADH存在下 ,电极过程由扩散控制 ,扩散系数为 1 .76× 1 0 -6cm2 /s.NADH浓度在 0 .0 1～ 5 .0 mmol/L范围内与峰电流呈现良好的线性关系 .通过计时安培法测得催化速率常数为 6.82× 1 0 3 mol-1· L· s-1.

钠、钾离子对肌质网囊泡NADH氧化酶和伴生超氧自由基的调控

目的探讨Na+、K+浓度对骨骼肌肌质网囊泡氧化还原系统的调控作用及对Ca2+释放通道的影响。方法提取肌质网囊泡,分别检测其在不同Na+、K+浓度下还原型辅酶Ⅰ(nicotinamideadeninednucleotide,NADH)氧化初速率、超氧产率、[3H]-ryanodine结合率和Ca2+释放速率的变化。结果高浓度的Na+、K+对肌质网NADH的氧化初速率和伴生的超氧自由基产率均有抑制作用;在[3H]-ryanodine结合实验中,高浓度的Na+、K+也压抑了NADH诱导的受配体结合的升高;同样,在Ca2+释放动力学实验中,不同浓度的K+调控了由NADH诱导的Ca2+释放初速率。结论骨骼肌肌质网膜上可能存在具有对Na+、K+浓度敏感并中介超氧自由基产生的NADH氧化还原系统,其参与调节Ca2+释放通道的活性。

NADH对L02细胞Bcl-2、Bax、P53、CD95及CD95L表达的影响

目的 研究抗氧化剂NADH对体外培养的正常人肝细胞系L0 2缺血再灌注损伤的保护作用及可能的机制。方法 实验分组 :将培养的L0 2细胞分为 :缺血再灌注损伤组 (I R) ,缺血再灌注损伤 +NADH(I R +NADH)及对照组 (未经处理的L0 2细胞 )。用流式细胞仪观察细胞处理后6、12、18及 2 4h细胞的凋亡率及 12h时 ,Bcl 2、Bax、P5 3、CD95及CD95L的表达 ,并以透射电镜观察细胞凋亡的超微结构。结果 NADH可明显抑制缺血再灌注损伤细胞的凋亡 ,并能上调Bcl 2表达 ,下调Bax、P5 3、CD95及CD95L的表达 ,与I R组相比较差异显著 (P <0 .0 5 )。透射电镜下可见典型的凋亡细胞的特征。结论 NADH对缺血再灌注损伤诱导的L0 2肝细胞有明显地保护作用。其作用机制可能与通过调节Bcl 2、Bax、P5 3。

肌红蛋白作催化剂荧光分析法高灵敏检测NADH

基于肌红蛋白对NADH与H2O2之间的反应具有催化作用,提出了一种催化荧光光谱测定NADH的新方法.在实验选定的最佳反应条件下,该反应体系的荧光强度与NADH的浓度在1.6×10-7～2.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为4.1×10-8mol/L.对1.0×10-6mol/LNADH的标准样品作了9次重复测定,其相对标准偏差RSD=4.6%.

聚硫堇修饰微带金电极的性质及对NADH的催化氧化

报道了硫堇在微带金电极上的电化学聚合过程，用红外光谱对聚硫堇进行了表征；研究了聚硫堇的电化学性质，发现聚硫堇在＋０．５～－０．７Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）电位范围内有两对氧化还原峰，峰电位分别为：Ｅ＝－０．０３Ｖ、Ｅ＝０．０５Ｖ，Ｅ＝－０．２４Ｖ、Ｅ＝－０．１７Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）。它们的式量电位Ｅ^（ｏ＇）随ｐＨ而变化，在弱酸性溶液中，Ｅ^（ｏ＇）／ｐＨ为－２９ｍＶ／ｐＨ（２５℃）；而在弱碱性溶液中则为－５６ｍＶ／ｐＨ。聚硫堇修饰微带金电极对ＮＡＤＨ的氧化具有催化作用，文中对电催化过程进行了探讨。

碳纳米管/壳聚糖修饰电极的制备及其对NADH的电催化氧化

本文用浓硝酸活化多层碳纳米管，将壳聚糖与活化后的碳纳米管制备成复合材料，并将其滴涂于玻碳电极表面，制备出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的电化学传感器。采用循环伏安法研究了该传感器的电化学性质以及对NADH的电催化氧化行为。实验结果表明，NADH在该电极上于＋0.37V（vs．SCE）左右出现一氧化峰，与未修饰的玻碳电极相比，该修饰电极明显降低了NADH的氧化峰电位，消除了反应中间产物对电极表面的污染问题。对实验条件进行了优化，建立了碳纳米管／壳聚糖修饰电极微分脉冲伏安法测定NADH的方法。本文方法具有较好的重现性和选择性，对NADH检测的线性范围为1.0×10^-4～9.0×10^-3mol／L，检测限为9．2×10^-5mol／L。

碳原子线修饰电极的循环伏安行为及其对NADH的电催化作用

研究了碳原子线修饰电极在 1 5 5～ 10 5 6pH值范围内的 9种不同电解质溶液中的循环伏安行为 ,发现该修饰电极本身具有电化学响应 .在pH值为 6 80的磷酸盐缓冲溶液中 ,与裸玻碳电极相比 ,1mM的NADH在碳原子线修饰电极上的氧化峰电位负移 0 3 90V ,氧化峰电流增加 4 1倍 ,显示该修饰电极具有突出的电催化活性 .

核黄素与NADH在紫光波段的激光诱导荧光光谱研究

基于细胞代谢荧光体的激光诱导荧光探测,在生物反应过程监测与生物活性物质探测中具有广泛的应用.本文利用波长可调谐激光光源,结合液体射流进样装置,研究了核黄素与NADH等生物荧光体在紫光波段(389 nm～404 nm)激发的荧光光谱,并考察了激光强度、样品浓度等参数对荧光光谱特性的影响.实验观察到核黄素的激发光谱在402.5 nm处出现"波谷",具有特征性,选择403.5 nm激光激发,核黄素的浓度灵敏度约为NADH的八百分之一.这些结果为发展生物荧光探测与识别技术提供了新的基础数据.

在Klebsiella pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH再生系统

生物法生产1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,1,3-PD)是当前工业生物技术研究的热点之一,生产过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-PD的产量和得率。采用PCR的方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码fdh的基因,将该基因片段插入载体pMALTM-p2X,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入醛脱氢酶失活菌KlebsiellapneumoniaeDA-1HB,获得重组菌KlebsiellapneumoniaeDAF-1。在IPTG浓度0.5mmol/L时,诱导3h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到4.82U/mg;与出发菌株K.pneumoniaeDA-1HB相比,重组菌DAF-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了19.2%。

天青Ⅰ修饰玻碳电极的电化学性质及其对NADH的催化氧化

本文利用滴涂于玻碳表面的Nation膜中负电性的磺酸基与天青Ⅰ阳离子之间的静电作用，以实现天青Ⅰ的固定化，从而制备出Nafion／天青Ⅰ电催化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）传感器。采用循环伏安法考察了传感器的电化学性质，并研究了该修饰电极对NADH的电催化作用。实验结果表明：该修饰电极对NADH有良好的电催化作用，NADH氧化峰电位比未修饰的玻碳电极负移了660mV，响应电流与NADH的浓度在8．7×10^-5～1．5×10^-2mol／L范围内呈良好的线性关系。该方法检出限为3．0×10^-5mol／L。

猪囊尾蚴线粒体NADH脱氢酶的基因克隆

目的 研究猪囊尾蚴线粒体 NADH脱氢酶亚单位 1基因的结构特点。 方法 提取猪囊尾蚴 m RNA,反转录合成 c DNA,构建 c DNA文库。用兔抗囊尾蚴抗血清筛选文库 ,得到阳性克隆 ,将其亚克隆到 p Bluescript SK质粒中测序 ,并与 Gen Bank中核苷酸序列进行同源性分析。 结果与结论 3次筛选得到 1个阳性克隆 ,其长度为 10 82bp。其中 1～ 5 78bp为开放阅读框 ,编码猪囊尾蚴线粒体 NADH脱氢酶亚单位 1的 192个氨基酸残基 ,5 79～ 10 82 bp为 t RNA- Asn、t RNA- Ile与 t RNA- Pro的基因编码区。

鲤NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因的克隆及低温适应相关性分析

根据鲤低温下特异表达的基因(片段)序列设计引物,采用2轮菌落PCR方法对鲤脑全长cDNA文库中的克隆进行筛选,确定了基因序列152在文库中的位置,经生物信息学比对分析确定其为NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因.这一基因在低温下的特异表达,对于低温下鱼类机体的供能,起着重要作用.结果还表明,NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因在鲤氧化呼吸链电子传递系统中与低温适应性状在一定程度上存在相关性.