基于线粒体NADH1基因对棘胸蛙养殖群体的遗传多样性分析

以江西省峡江、靖安、金溪、明月山、于都5个地理群体138只棘胸蛙为研究对象,通过PCR扩增获得序列长度为1187 bp的线粒体NADH1基因全序列,共检测出变异位点101个,其中简约信息位点96个,单突变位点5个,无缺失和插入。138条序列共定义了41个单倍型,平均单倍型多样性为0.956;平均核苷酸多样性为0.0232,平均核苷酸差异数(K)为27.514。群体间的平均遗传距离为0.024~0.035,除峡江群体与于都群体外遗传分化指数F_(st)值均大于0.05,群体间存在显著的遗传分化。AMOVA结果显示,江西省棘胸蛙变异主要来源于群体内(63.06%)。单倍型系统发育树显示,41个单倍型NJ聚类为3个分支。中性检验结果表明5个棘胸蛙养殖群体历史上未经历种群扩张。

滑液囊支原体NADH氧化酶单克隆抗体的制备

为制备滑液囊支原体NADH氧化酶(NOX)的单克隆抗体。将本实验室前期构建好的重组菌株E.coliBL21(pET28a-NOX),进行诱导表达,经过纯化后免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选结合有限稀释法克隆化,得到1株稳定分泌抗MSNOX抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F4。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,该单克隆抗体为IgG2b亚类,间接ELISA测定单克隆抗体腹水效价为1∶2048000。经Westernblot和悬浮免疫荧光试验鉴定,该株单克隆抗体与MS不同分离株均发生特异性反应,与其他禽致病菌不发生反应。通过染色体分析,该杂交瘤细胞株2F4有98±5条染色体,符合杂交瘤细胞染色体的数目,证实细胞融合成功。本研究成功制备NADH氧化酶单克隆抗体,为建立滑液囊支原体的检测方法及进一步研究NADH氧化酶在MS致病机制中的作用提供了重要的生物材料。

一例基于NADH5标记的豹亚种鉴别

以动物园为代表的圈养环境是开展野生动物迁地保护、繁育、科普宣传的重要场地,亦为开展科学研究等提供了宝贵资源。而圈养环境中的国家一级重点保护动物豹(Pantera pardus)的遗传资源则为了解其野生种群提供了窗口。本研究以郑州市动物园圈养的1只雌性豹为对象,通过提取该个体的基因组DNA并进行PCR扩增与测序,利用所获得的NADH5基因片段探究该个体属何豹亚种。经与NCBI数据库比对以及系统发生分析,本研究显示该个体属于豹华北亚种(P. p. fontanierii)。基于本研究,建议开展国内圈养豹遗传资源调查,以便系统地开展圈养豹的保护、繁育工作。

具有电子转移路径的金属化氮化碳选择性再生NADH和光酶偶联CO_(2)还原

将CO_(2)转化为燃料和化学品被认为是缓解能源危机的一种有效策略.受自然光合作用的启发,光酶偶联结合了光催化和酶催化的优点,在绿色生物制造中具有较好的应用前景.铑(Rh)络合物是选择性再生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(M-NADH)的关键介体,其固定化可以提高体系的可持续性,并有效缩短电子传递路径,因而受到广泛关注.本文制备了联吡啶功能化的金属化氮化碳(PCNRhbpy_(4)),用于光酶偶联催化CO_(2)还原.首先以双氰胺为前驱体,通过两步退火法制备氮化碳(PCN),再与5,5’-二氨基-2,2’-联吡啶(DABP)进一步热缩合,然后锚定[Cp*RhCl2]2获得PCNRhbpy4,并通过透射电镜、扫描电镜、粉末X射线衍射、紫外可见光吸收光谱、瞬态表面光电压和荧光发射光谱等进行表征.结果表明,合成的PCNRhbpy4材料具有掺杂石墨烯结构,且通过残余的末端联吡啶结构均匀地固定了Rh络合物.以PCNRhbpy4作为光催化剂实现了1,4-NADH的100%选择性再生,并在2.0 min内实现了80%的NADH再生.进一步耦合固定在疏水膜上的甲酸脱氢酶,可以有效地将CO_(2)还原为甲酸盐,48 h内甲酸盐浓度达到7 mmol L^(-1).此外,光催化剂的循环实验结果表明,PCNRhbpy4具有较高的稳定性.反应机理研究结果表明,光生电子经N-掺杂石墨烯传递到Rh活性位点,并结合溶液中的质子,随后氢负离子通过环滑移机制传递到NAD+,高选择性再生1,4-NADH.综上,本文为Rh的固定化开辟了一条新路径,实现了光酶催化CO_(2)还原,为光酶催化在绿色生物制造的实际应用提供参考.

浅谈NADH与NADPH

NADH和NADPH是细胞代谢过程中的重要辅酶,从物质本质角度认识两种辅酶的作用机理,解答教学过程中学生提出的问题。

甲酸脱氢酶用于辅酶NADH再生的研究进展

NADH依赖型氧化还原酶广泛应用于精细化学品和手性化合物的生物合成,其中辅酶NADH作为还原当量起着关键的作用,NADH的再生关系到生物氧化还原过程能否进行.甲酸脱氢酶在辅酶NADH再生中的应用是目前代谢工程领域研究的热点之一.本工作回顾了甲酸脱氢酶的来源和氨基酸序列、酶的理化性质和催化机理等方面的研究进展,从化学稳定性、热稳定性和成本等方面阐述了甲酸脱氢酶在辅酶再生系统中的应用,讨论了甲酸脱氢酶用于辅酶再生的代谢工程平台的发展趋势,并对研究发展方向提出了一些设想.

高效液相色谱法测定骨骼肌ATP、ADP、AMP、NAD^+、NADH含量

采用高效液相色谱法测定骨骼肌腺嘌呤核苷酸和辅酶Ⅰ含量。高压液相系 统包括：惠普公司ＺＯＢＡＸ－Ｃ１８反相柱５ｍｍ×１２ｃｍ，５９０ＵＶ检测器。流动相为２２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液，内含１０％甲醇，用四丁基氢氧化胺ＴＢＡＨ调ｐＨ至６５。等比洗脱，流速为０８ｍｌ／ｍｉｎ。检测波长为２５４ｎｍ。所有样品和标准品在进样前均用０４５μｍ孔径的虑膜过滤后进样５μｌ作色谱分析。结果表明：ＨＰＬＣ可以同时测定ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ，分离效率高，操作简便，快速每个样品仅需１５分钟，而且，重现性好，定性可靠，定量准确。

阿魏酸聚合修饰玻碳电极的制备及其对NADH的催化氧化

研究了阿魏酸修饰电极的制备、性质及对 NADH的电催化作用 .该电极在 0 .1 mol/L磷酸缓冲溶液( p H =6.60 )中 ,于 -0 .1～ +0 .5 0 V ( vs. Ag/Ag Cl)电位范围内呈现一对氧化还原峰 ,其式量电位 E0 为+0 .1 88V( vs.Ag/Ag Cl) ,且 E0 随 p H增加而负向移动 .电子转移系数为 0 .496,表观电极反应速率常数( ks)为 6.6s-1.电极反应的电子数为 1且有 1个质子参与 .该修饰电极对 NADH氧化具有很好的催化作用 .在 NADH存在下 ,电极过程由扩散控制 ,扩散系数为 1 .76× 1 0 -6cm2 /s.NADH浓度在 0 .0 1～ 5 .0 mmol/L范围内与峰电流呈现良好的线性关系 .通过计时安培法测得催化速率常数为 6.82× 1 0 3 mol-1· L· s-1.

钠、钾离子对肌质网囊泡NADH氧化酶和伴生超氧自由基的调控

目的探讨Na+、K+浓度对骨骼肌肌质网囊泡氧化还原系统的调控作用及对Ca2+释放通道的影响。方法提取肌质网囊泡,分别检测其在不同Na+、K+浓度下还原型辅酶Ⅰ(nicotinamideadeninednucleotide,NADH)氧化初速率、超氧产率、[3H]-ryanodine结合率和Ca2+释放速率的变化。结果高浓度的Na+、K+对肌质网NADH的氧化初速率和伴生的超氧自由基产率均有抑制作用;在[3H]-ryanodine结合实验中,高浓度的Na+、K+也压抑了NADH诱导的受配体结合的升高;同样,在Ca2+释放动力学实验中,不同浓度的K+调控了由NADH诱导的Ca2+释放初速率。结论骨骼肌肌质网膜上可能存在具有对Na+、K+浓度敏感并中介超氧自由基产生的NADH氧化还原系统,其参与调节Ca2+释放通道的活性。

NADH对L02细胞Bcl-2、Bax、P53、CD95及CD95L表达的影响

目的 研究抗氧化剂NADH对体外培养的正常人肝细胞系L0 2缺血再灌注损伤的保护作用及可能的机制。方法 实验分组 :将培养的L0 2细胞分为 :缺血再灌注损伤组 (I R) ,缺血再灌注损伤 +NADH(I R +NADH)及对照组 (未经处理的L0 2细胞 )。用流式细胞仪观察细胞处理后6、12、18及 2 4h细胞的凋亡率及 12h时 ,Bcl 2、Bax、P5 3、CD95及CD95L的表达 ,并以透射电镜观察细胞凋亡的超微结构。结果 NADH可明显抑制缺血再灌注损伤细胞的凋亡 ,并能上调Bcl 2表达 ,下调Bax、P5 3、CD95及CD95L的表达 ,与I R组相比较差异显著 (P <0 .0 5 )。透射电镜下可见典型的凋亡细胞的特征。结论 NADH对缺血再灌注损伤诱导的L0 2肝细胞有明显地保护作用。其作用机制可能与通过调节Bcl 2、Bax、P5 3。

肌红蛋白作催化剂荧光分析法高灵敏检测NADH

基于肌红蛋白对NADH与H2O2之间的反应具有催化作用,提出了一种催化荧光光谱测定NADH的新方法.在实验选定的最佳反应条件下,该反应体系的荧光强度与NADH的浓度在1.6×10-7～2.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为4.1×10-8mol/L.对1.0×10-6mol/LNADH的标准样品作了9次重复测定,其相对标准偏差RSD=4.6%.

聚硫堇修饰微带金电极的性质及对NADH的催化氧化

报道了硫堇在微带金电极上的电化学聚合过程，用红外光谱对聚硫堇进行了表征；研究了聚硫堇的电化学性质，发现聚硫堇在＋０．５～－０．７Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）电位范围内有两对氧化还原峰，峰电位分别为：Ｅ＝－０．０３Ｖ、Ｅ＝０．０５Ｖ，Ｅ＝－０．２４Ｖ、Ｅ＝－０．１７Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）。它们的式量电位Ｅ^（ｏ＇）随ｐＨ而变化，在弱酸性溶液中，Ｅ^（ｏ＇）／ｐＨ为－２９ｍＶ／ｐＨ（２５℃）；而在弱碱性溶液中则为－５６ｍＶ／ｐＨ。聚硫堇修饰微带金电极对ＮＡＤＨ的氧化具有催化作用，文中对电催化过程进行了探讨。

碳纳米管/壳聚糖修饰电极的制备及其对NADH的电催化氧化

本文用浓硝酸活化多层碳纳米管，将壳聚糖与活化后的碳纳米管制备成复合材料，并将其滴涂于玻碳电极表面，制备出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的电化学传感器。采用循环伏安法研究了该传感器的电化学性质以及对NADH的电催化氧化行为。实验结果表明，NADH在该电极上于＋0.37V（vs．SCE）左右出现一氧化峰，与未修饰的玻碳电极相比，该修饰电极明显降低了NADH的氧化峰电位，消除了反应中间产物对电极表面的污染问题。对实验条件进行了优化，建立了碳纳米管／壳聚糖修饰电极微分脉冲伏安法测定NADH的方法。本文方法具有较好的重现性和选择性，对NADH检测的线性范围为1.0×10^-4～9.0×10^-3mol／L，检测限为9．2×10^-5mol／L。

过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度。【方法】将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata CCTCCM202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U/mg蛋白的重组菌T.glabrata-PDnoxE。【结果】与出发菌株T.glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕。补加50g/L葡萄糖继续发酵20h,则使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%。【结论】增加细胞内NAD+含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度。

碳原子线修饰电极的循环伏安行为及其对NADH的电催化作用

研究了碳原子线修饰电极在 1 5 5～ 10 5 6pH值范围内的 9种不同电解质溶液中的循环伏安行为 ,发现该修饰电极本身具有电化学响应 .在pH值为 6 80的磷酸盐缓冲溶液中 ,与裸玻碳电极相比 ,1mM的NADH在碳原子线修饰电极上的氧化峰电位负移 0 3 90V ,氧化峰电流增加 4 1倍 ,显示该修饰电极具有突出的电催化活性 .

核黄素与NADH在紫光波段的激光诱导荧光光谱研究

基于细胞代谢荧光体的激光诱导荧光探测,在生物反应过程监测与生物活性物质探测中具有广泛的应用.本文利用波长可调谐激光光源,结合液体射流进样装置,研究了核黄素与NADH等生物荧光体在紫光波段(389 nm～404 nm)激发的荧光光谱,并考察了激光强度、样品浓度等参数对荧光光谱特性的影响.实验观察到核黄素的激发光谱在402.5 nm处出现"波谷",具有特征性,选择403.5 nm激光激发,核黄素的浓度灵敏度约为NADH的八百分之一.这些结果为发展生物荧光探测与识别技术提供了新的基础数据.

在Klebsiella pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH再生系统

生物法生产1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,1,3-PD)是当前工业生物技术研究的热点之一,生产过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-PD的产量和得率。采用PCR的方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码fdh的基因,将该基因片段插入载体pMALTM-p2X,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入醛脱氢酶失活菌KlebsiellapneumoniaeDA-1HB,获得重组菌KlebsiellapneumoniaeDAF-1。在IPTG浓度0.5mmol/L时,诱导3h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到4.82U/mg;与出发菌株K.pneumoniaeDA-1HB相比,重组菌DAF-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了19.2%。

天青Ⅰ修饰玻碳电极的电化学性质及其对NADH的催化氧化

本文利用滴涂于玻碳表面的Nation膜中负电性的磺酸基与天青Ⅰ阳离子之间的静电作用，以实现天青Ⅰ的固定化，从而制备出Nafion／天青Ⅰ电催化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）传感器。采用循环伏安法考察了传感器的电化学性质，并研究了该修饰电极对NADH的电催化作用。实验结果表明：该修饰电极对NADH有良好的电催化作用，NADH氧化峰电位比未修饰的玻碳电极负移了660mV，响应电流与NADH的浓度在8．7×10^-5～1．5×10^-2mol／L范围内呈良好的线性关系。该方法检出限为3．0×10^-5mol／L。

猪囊尾蚴线粒体NADH脱氢酶的基因克隆

目的 研究猪囊尾蚴线粒体 NADH脱氢酶亚单位 1基因的结构特点。 方法 提取猪囊尾蚴 m RNA,反转录合成 c DNA,构建 c DNA文库。用兔抗囊尾蚴抗血清筛选文库 ,得到阳性克隆 ,将其亚克隆到 p Bluescript SK质粒中测序 ,并与 Gen Bank中核苷酸序列进行同源性分析。 结果与结论 3次筛选得到 1个阳性克隆 ,其长度为 10 82bp。其中 1～ 5 78bp为开放阅读框 ,编码猪囊尾蚴线粒体 NADH脱氢酶亚单位 1的 192个氨基酸残基 ,5 79～ 10 82 bp为 t RNA- Asn、t RNA- Ile与 t RNA- Pro的基因编码区。

鲤NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因的克隆及低温适应相关性分析

根据鲤低温下特异表达的基因(片段)序列设计引物,采用2轮菌落PCR方法对鲤脑全长cDNA文库中的克隆进行筛选,确定了基因序列152在文库中的位置,经生物信息学比对分析确定其为NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因.这一基因在低温下的特异表达,对于低温下鱼类机体的供能,起着重要作用.结果还表明,NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因在鲤氧化呼吸链电子传递系统中与低温适应性状在一定程度上存在相关性.