柯萨奇病毒B3(CVB3)通过激活NADK2促进小鼠巨噬细胞NLRP3的活化

目的研究在柯萨奇病毒B3(CVB3)刺激下,小鼠巨噬细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)表达的变化及机制。方法CVB3刺激RAW264.7细胞、小鼠原代(骨髓来源或腹腔)巨噬细胞以及感染NLRP3短发夹RNA(shRNA-NLRP3)慢病毒的RAW264.7细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3和白细胞介素1β(IL-1β)表达水平;ELISA检测细胞上清中IL-1β的含量;Western blot法检测NLRP3蛋白的变化,免疫共沉淀(Co-IP)法检测NLRP3相互作用蛋白的表达。结果CVB3刺激RAW264.7细胞、骨髓来源或腹腔巨噬细胞后,NLRP3和IL-1β表达明显升高;下调NLRP3后,IL-1β分泌明显减少;NLRP3抗体Co-IP所得复合物银染,组间差异蛋白经质谱分析鉴定为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶2(NADK2),证明CVB3诱导NADK2与NLRP3相互作用。结论CVB3通过激活NADK2促进巨噬细胞NLRP3活化,增加炎症因子IL-1β表达和释放。

高GC含量基因NADK2的扩增及其真核表达载体的构建

在构建线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide kinase,NADK2)真核表达载体时,该文发现,使用Ex Taq DNA聚合酶扩增无法得到其编码区域全长,5′端缺失一段DNA片段。对其cDNA序列进行分析发现,NADK2编码区GC含量不均衡。起始密码子附近GC含量最高可达92.5%,而3′端终止密码子附近GC含量最低只有27.5%。之后,使用LA Taq及GC缓冲液进行扩增,得到了NADK2基因ORF(open reading frame)全长,并克隆入真核表达载体。该文结果对类似高GC含量DNA片段的PCR扩增有一定的提示作用。