甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因(SoNADP-IDH)的克隆与表达分析

【目的】甘蔗是C4作物,是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶(So NADP-IDH)基因,为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点,用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定,用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So NADP-IDH,用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析,并用q RT-PCR技术研究So NADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因,命名为So NADP-IDH,Gen Bank登录号为KF808326。该c DNA全长1 497 bp,含有1个1 239 bp的完整开放阅读框(ORF),编码412个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白为亲水蛋白,不含信号肽,为稳定蛋白,有跨膜区域,为可溶性蛋白,二级结构分析显示,含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明,So NADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白有很高的同源性,与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,So NADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达,在甘蔗体内为组成型表达,在生物胁迫(RSD病菌)和4种非生物胁迫下低温(4℃)、干旱(PEG)、高盐(Na Cl)和激素(ABA)均可影响So NADP-IDH在甘蔗体内的表达,且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下,So NADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式,6 h表达量升到最高,之后又开始持续下降,在处理48 h时表达量降到最低;在4℃处理的低温胁迫下,3 h时,So NADP-IDH的表达量降到最低,之后随着处理时间的延长,So NADP-IDH的表达量增加,24 h升到最高点,48 h时,又有稍微下降;在ABA作用下,So NADP-IDH表现出"抑-扬-抑-扬"的表达模式,在处理3 h时So NADP-IDH表达量有所降低,6 h时升到最高,在处理24 h时降到最低,48 h又有所上升;在Na Cl模拟的高盐胁迫下,So NADP-IDH表现出"扬-抑-扬"的表达模式,So NADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高,之后开始急剧下降,24 h时降到最低,之后开始有所上升,48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶(So NADP-IDH)基因,RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到So NADP-IDH在甘蔗体内的表达水平,该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。

NADP-异柠檬酸脱氢酶的结构与功能

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)在三羧酸(TCA)循环中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,将NAD+或NADP+还原成NADH或NADPH.根据空间结构特点,NADP-依赖性IDH可分为同源二聚体IDH和单体IDH,它们对生物体的能量代谢、生物合成以及抗氧化胁迫起重要作用.当碳源贫乏时,NADP-依赖性IDH的可逆磷酸化对TCA循环和乙醛酸旁路碳通量(carbon flux)的分配起关键性调控作用.因此目前IDH是研究蛋白质的结构与功能关系、酶的催化与调节机制、蛋白质功能进化的最好模型之一.