鼻咽癌相关基因NAG4编码蛋白的表达模式

目的:明确人鼻咽癌相关基因NAG4编码产物的特性和活细胞内定位,了解其与癌变的关系。方法:构建了绿色荧光蛋白GFP与NAG4融合基因的真核表达载体,通过脂质体介导分别转染非洲绿猴肾永生化细胞系COS7、人宫颈癌细胞系HeLa、人鼻咽癌细胞系HNE1以及原代培养正常鼻咽上皮PNNE,瞬时表达后荧光显微镜观察NAG4编码蛋白的活细胞内定位及其在鼻咽癌中改变。结果:NAG4基因编码产物在COS7细胞的胞浆和胞核内可见表达,而在HeLa细胞中仅在细胞浆存在;有30％的鼻咽癌细胞仅分布在胞浆,而在所有的正常鼻咽上皮细胞胞核和胞浆均有表达。结论:NAG4基因编码核转录蛋白在细胞恶变过程中可能有细胞浆到细胞核的移位障碍。

人胚鼻咽上皮细胞cDNA文库的构建及鼻咽癌相关基因的筛选

为了进一步分离人鼻咽组织特异性表达基因和鼻咽癌特异相关基因 ,采用SMART (switchingmechanismat 5′endofRNAtranscript)技术 ,构建了人胚鼻咽上皮cDNA文库 .从原代培养的人胚鼻咽上皮分离总RNA并纯化mRNA ,利用经修饰的oligo (dT)引物 (含sfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第一链 ,同时根据真核生物mRNA5′端帽子结构特点 ,利用SMART核苷酸 (含sfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第一链在mRNA 5′端延伸出去的模板 ,进而以此序列为引物利用LD PCR (long distance PCR)合成双链cDNA ,双链cDNA经sfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经sfiⅠ酶切的λTrip1EX2载体后经体外包装而成cDNA文库 .结果表明 ,原始人胚鼻咽上皮cDNA文库获得 1 0× 10 6个重组子 ,重组率达 96 % .文库扩增后 ,滴度达 7 8× 10 9pfu ml,插入cDNA平均长度为 1 2kb ,用PCR从该文库扩增出本实验室新克隆的鼻咽癌相关基因NAG4的全长cDNA .构建的人胚鼻咽上皮cDNA文库具有良好的质量 ,该cDNA文库为进一步筛选。