利用pTet-Off系统研究NAIF1对食管癌细胞系EC9706生物学行为的影响

目的:利用pTet-off可诱导表达系统将NAIF1重组质粒导入食管癌EC9706中进行生物学行为影响研究。方法:构建pTRE2-NAIF1质粒,与PTK-Hyg质粒共转染入可诱导表达细胞系TF93(由EC9706构建而得),经筛选并鉴定获得稳定可诱导表达克隆。以此克隆采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测细胞周期、Transwell小室法检测细胞迁移和检测细胞黏附能力的改变。结果:经筛选并鉴定获得了稳定的可诱导表达TF93-pTRE2-NAIF1克隆。NAIF1在体外可以抑制EC9706细胞增殖、导致G0/G1期细胞阻滞、抑制其迁移和黏附能力。结论:NAIF1能抑制食管癌细胞系EC9706的恶性生物学行为,为食管癌的基因治疗提供了可能的新靶点。

NAIF1对胃癌细胞中IFIT家族蛋白的影响

目的探讨核诱导凋亡因子NAIF1在胃癌细胞系MKN45中的功能。方法构建带有Tet-on系统的质粒pLVX-Tight-Flag-NAIF1-puro,在胃癌细胞系MKN45中,加入四环素衍生物强力霉素(Dox)诱导NAIF1表达,分别在加入Dox之后0、6、12、24 h收取细胞进行基因表达谱芯片检测,对差异表达的基因进行生物学分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术验证筛选的目的差异基因在mRNA和蛋白水平上的变化。结果基因芯片测定结果显示干扰素诱导蛋白(IFIT)家族基因分子IFIT1、IFIT2和IFIT3在第24 h表达量明显增加,qRT-PCR同样表现出该变化,Western blot在蛋白水平进一步验证了该变化。IFIT家族另一成员IFIT5在mRNA和蛋白水平表达量的变化趋势并不明显。结论胃癌细胞中过表达NAIF1能够促进免疫系统相关的部分干扰素诱导蛋白(IFIT)家族蛋白的表达。

NAIF1对肝癌细胞HepG2增殖与迁移能力的影响

目的:在肝癌细胞Hep G2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对Hep G2增殖和迁移能力的影响。方法:以真核表达质粒p EGFP-N1为对照组,p EGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞Hep G2,利用免疫印迹方法检测NAIF1蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对Hep G2迁移能力的影响。结果:在肝癌细胞Hep G2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组Hep G2/p EGFP-N1相比,Hep G2/p EGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P<0.05)。结论:外源表达NAIF1蛋白定位于Hep G2细胞核,过表达NAIF1抑制Hep G2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点。

过表达核凋亡诱导因子1增强鼻咽癌细胞放射敏感性

目的探究核凋亡诱导因子1(nuclear apoptosis-inducing factor 1,NAIF1)对鼻咽癌细胞CNE-2R放射敏感性的影响。方法采用Western blot检测NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2和CNE-2R的表达水平。通过慢病毒感染技术将NAIF1过表达慢病毒(LV-NAIF1组)及其阴性对照慢病毒(LV-NC组)分别感染CNE-2R细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测NAIF1的mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8、克隆形成实验分别检测各组细胞在不同照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射下的增殖能力、克隆形成能力并计算相应的存活分数,采用流式细胞术实验检测各组细胞6 Gy照射前后的细胞周期分布情况。结果与CNE-2细胞相比,NAIF1在CNE-2R细胞中的蛋白表达水平显著降低(P<0.001)。与LV-NC组相比,LV-NAIF1组CNE-2R细胞中NAIF1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均P<0.001)。经不同剂量照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可以抑制CNE-2R细胞的增殖能力(均P<0.05),降低CNE-2R细胞的克隆形成数和存活分数(P<0.05)。经6 Gy照射后,与LV-NC组相比,过表达NAIF1可使更多的CNE-2R细胞滞留在G2/M期(P<0.01)。结论NAIF1在鼻咽癌细胞CNE-2R中低表达,过表达NAIF1可能通过抑制细胞增殖并将细胞周期阻滞在G2/M期,从而增强鼻咽癌细胞CNE-2R的放射敏感性。

人细胞核诱导凋亡因子1在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人核凋亡诱导因子1(NAIF1)原核表达质粒,在大肠杆菌中表达及纯化NAIF1融合蛋白,制备兔抗NAIF1多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:PCR法获得人NAIF1序列并将其克隆到原核表达载体pET-32a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,经变性、Ni+柱亲和纯化、复性后得到纯化的重组人NAIF1蛋白,免疫大耳白兔,制备兔抗人NAIF1多抗血清,以ELISA和Westernblot方法检测其效价和特异性。结果:成功获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和高效价的兔抗人NAIF1多抗血清,ELISA检测多抗效价达到1∶500000,Westernblot检测证明多抗特异性良好。结论:获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和兔抗人NAIF1多抗血清,为后续针对NAIF1基因功能的研究提供了重要实验材料。

凋亡相关基因的整合分析及基因表达芯片的制备

利用IPI和GenBank,收集了与凋亡相关的5333条基因序列,用一定的标准,整合筛选得到1384个凋亡相关的基因.通过亚细胞定位、组织表达差异显著性分析、自然正义/反义RNA对预测、基因簇在pathway上的定位、蛋白质/蛋白质相互作用等方面的分析发现,一些基因只在一个组织里显著差异表达,一些基因存在自然正义/反义RNA对现象,一些基因簇同时位于多条pathway等重要信息.同时,制作了一张凋亡相关基因的寡核苷酸芯片,并且对于一对NAIF1表达质粒转染前后的HeLa样品,通过该芯片的筛选,得到24个差异表达的基因.发现NAIF1过表达诱导的细胞凋亡,伴随了PAX2、PDCD8、PDCD10、DFFA、CASP7等基因表达的显著变化,同时还发现,U58668,该mRNA没有任何基因或蛋白质的注释信息,当camptothecin诱导U937细胞系凋亡时上调,在这里的NAIF1过表达诱导的HeLa细胞系中也上调(上述数据结果见http://gpcrome.cbi.pku.edu.cn:2005/chip).

人重组核凋亡诱导因子1截短体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的核凋亡诱导因子1(Nuclearapoptosis-inducingfactor1,NAIF1)是本实验室首次克隆和鉴定的新凋亡基因,为了通过Polldown实验研究其结合蛋白,在大肠杆菌中表达和纯化人重组NAIF1(73-327)的截短体。方法通过PCR方法扩增出NAIF1(73-327)cDNA,并插入pGEX-KG载体,实现插入基因的融合表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Westernblot和电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS)检测分析。结果DNA测序结果证实成功构建了重组融合表达质粒pGEX-KG-NAIF1(73-327),并在大肠杆菌中稳定表达,表达产物分子量约为53kD,与预期一致,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化蛋白经Westernblot和二级质谱(MS/MS)分析证明表达蛋白为GST-NAIF1(73-327)融合蛋白。结论获得了重组GST-NAIF1(73-327)融合蛋白的高效表达,为下阶段NAIF1的结构与功能研究打下了基础。