西瓜NAS基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

为了探究西瓜NAS基因家族的生物学功能,基于西瓜全基因组组装注释数据,利用HMMER、MEGA、TBtools等工具对西瓜NAS家族进行生物信息学的鉴定和分析,包括染色体定位、蛋白质结构、蛋白保守基序、系统进化树、启动子顺式作用元件和共线性分析。结果表明:在西瓜全基因组中共鉴定出4个ClaNAS基因,分布于2号染色体、3号染色体、6号染色体上;编码的氨基酸数量变化范围为277~356aa、分子量为30.68~39.88kDa、等电点为4.71~7.46;4个claNAS成员编码蛋白质的二级结构组成一致,三级结构差异明显;拟南芥、水稻、甜瓜、番茄和西瓜5个物种的NAS基因家族被分为3个亚族,其中葫芦科植物被单独聚为一类;西瓜NAS基因家族的启动子区含有激素应答、光响应、胁迫应答、转录因子结合位点等多种顺式作用元件;西瓜基因组内未发现NAS基因的串联重复和片段复制,但西瓜NAS基因与拟南芥、番茄的NAS基因间分别存在2个共线性基因对。西瓜NAS基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析为进一步研究西瓜NAS基因的功能和分子机制提供了依据。

拟南芥35S∶NAS2载体构建和转基因株系的筛选

为了研究基因NAS2和BZIP44在拟南芥缺铁胁迫响应中的遗传关系,文章以野生型(wild type,WT)拟南芥为材料构建35S∶NAS2/WT转基因植株,以拟南芥突变体bzip44为材料构建35S∶NAS2/bzip44转基因植株;提取野生型拟南芥的RNA,以其反转成的cDNA作为模板克隆NAS2的CDS区域,将双酶切后的目的片段与同样双酶切的pART27质粒进行连接,得到的连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中,通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定和测序得到阳性单克隆,然后将重组质粒转入农杆菌感受态GV3101中,获得阳性单克隆菌落;用浸花法分别侵染野生型拟南芥和纯合的拟南芥bzip44突变体植株,通过筛选和鉴定得到纯合的35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44转基因植株。研究结果为基因NAS2和BZIP44在拟南芥缺铁胁迫响应中的遗传关系提供参考。

2022-2023年山东省A(H1N1)pdm09流感病毒HA、NA基因变异特征分析

目的 了解山东省2022-2023流感监测年度分离的A(H1N1)pdm09亚型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因的变异特征,为流感的防控提供科学依据。方法 从流感监测网络实验室分离的流感毒株中按地市随机选取14株A(H1N1)pdm09亚型流感毒株,以WHO推荐的当季疫苗株为参考进行全基因组测序,并采用荧光法开展神经氨酸酶抑制(neuraminidase inhibition,NI)实验以评估药物敏感性。结果 山东省2022-2023年度分离的A(H1N1)pdm09流感病毒属于6B.1A分支中的5a.2a进化簇,核苷酸序列比对分析显示,HA和NA基因与2021-2023年度北半球疫苗株A/Victoria/2570/2019的亲缘关系较为接近,同源性分别为98.5%~98.7%和98.8%~99.1%。氨基酸序列分析显示,HA蛋白有20个位点发生了氨基酸序列变异,并发现1株病毒可能发生抗原漂移,有3株病毒发生了HA蛋白糖基化位点的缺失。NA酶相关重要位点未发生变异。NI实验显示,所测流感毒株均对抗流感病毒药物敏感。结论 所监测毒株与疫苗株整体同源性很高,但氨基酸存在一定程度变异,今后有必要持续开展流感病毒基因变异特征监测以了解流感流行的风险,以及评价基因变异对流感疫苗和治疗药物效果的影响。

共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPF鸡的免疫效力试验

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的致死性攻击;并可有效阻止病毒在泄殖腔的排出。而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡。

禽流感病毒KMI/99(H9N2)HA和NA基因的序列分析

研究分别以自行设计的一对简并引物和另一对普通引物 ,经RT PCR ,一次性成功地扩增禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2 )HA全长基因cDNA和NA全长基因cDNA ,并将它们克隆于 pGEM TEasy的T T窗口。首次报道了该毒株的HA全基因和NA全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。测序结果显示 ,该毒株的HA基因全长为 16 83bp ,编码 5 6 0个氨基酸。NA全长为 1398bp ,编码 46 6个氨基酸残基。研究发现其HAI羧基端的分子特征是 :R S S R。从分子水平推论 :A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2 )属于非高致病力毒株。研究还发现NA蛋白于 6 3— 6 5位缺失了T、E、I三个氨基酸。

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。

新型甲型H_1N_1流感毒株NA基因特征和进化

目的通过对新型甲型H1N1流感毒株神经氨酸酶(NA)基因序列的变异分析,揭示毒株NA基因变异与进化。方法检测广东地区分离毒株NA基因核苷酸序列,同时对全球新型甲型H1N1流感毒株NA基因进行检索下载,采用Lasergene 7.1软件比对和分析NA基因核苷酸和氨基酸序列,结合临床资料分析变异基因进化,同时分析糖基化位点。结果 2009年4-12月69株毒株NA基因16个氨基酸位点置换,占3.41%(16/469);NA蛋白主要置换位点在V106I/H和N248D。毒株GD-801-2009(H1N1)和GD-1202-2009的NA基因明显受到的感染宿主选择性作用,而毒株GD-1-2009的NA基因明显受到的感染宿主负选择性作用。与毒株GD-1-2006(H5N1)NA基因比较,毒株GD-801-2009的NA基因插入Nt145-204,导致H1N1NA蛋白增加第49～68位氨基酸(CNQSVITYENNTWVNQTYVN),其中包括4个糖基化位点。结论广东新型甲型H1N1流感毒株NA基因正向不同方向进化;新型甲型H1N1流感NA蛋白新增4个糖基化位点。

禽流感病毒H9N2亚型西藏分离株HA和NA基因的克隆与序列分析

为了从分子水平上掌握西藏各地区H9亚型禽流感病毒的遗传进化情况及其与国内外H9亚型禽流感病毒的变异情况和流行规律之间的关系,作者选择了2009年不同时间从西藏部分地市养殖场分离的3株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,3株西藏分离病毒之间的HA和NA基因变异程度不大,同源性达到98%以上,在遗传进化中均属于欧亚分支中的类Bj/94亚分支,3株西藏分离毒的HA基因与Bj/94的同源性在核苷酸水平为88.7%～88.8%,在氨基酸水平为93.4%～93.6%;NA基因与Bj/94的同源性在核苷酸水平为92.7%～93.0%,在氨基酸水平为93.4%～94.0%;3株西藏分离毒株可能与Bj/94由同一毒株进化而来。由于基因突变使Tb/1毒株的HA基因在313位出现了1个新的糖基化位点,Tb/4毒株的NA基因缺失了146位的糖基化位点;唾液酸吸附位点上有明显的突变;HA的裂解位点附近和NA基因的受体结合位点区域内都有氨基酸突变。HA和NA基因的变异可能与适应高原缺氧、高海拔等特殊气候环境有关。

山东地区10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的遗传演化分析

为了解2016年山东地区H9N2亚型禽流感病毒的变异情况,选取分离鉴定的10株H9N2亚型禽流感病毒分离毒株,分别对其HA和NA基因进行序列测定和分子特性分析,并应用Mega 5.0软件绘制相应的基因氨基酸进化树,进行遗传进化分析。结果表明:10株H9N2分离毒的HA裂解位点氨基酸均为RSSR/GLF,具有典型低致病性AIV HA基因的特征;其第226位氨基酸均为亮氨酸(L),因此具有结合人流感受体的分子特性。同时这10株病毒的NA基因颈部均有9个核苷酸的缺失,且NA的潜在糖基化位点均不超过8个。进化树分析表明,2016年山东地区H9N2流行毒株HA和NA基因均属A/Chicken/Beijing/1/1994亚群,并且同属于近几年在中国鸡群中流行的G57分支。

2株H3N8亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传变异分析

采用RT-PCR技术扩增了2株H3N8亚型流感毒株A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010的HA和NA基因,并与GenBank中收录的其他毒株序列进行比较分析和遗传进化分析。结果表明,分离株的HA与NA基因全长分别为1 733 bp、1 432 bp。A/duck/Guangxi/69/2009株的HA基因与A/duck/Siberia/100/01株的相似性最高,A/chicken/Guangxi/2117/2010株的HA基因与A/white munia/HongKong/4519/00株的相似性最高;而A/duck/Guangxi/69/2009株的NA基因与A/duck/Eastern China/91/09株的相似性最高,A/chicken/Guangxi/2117/2010株的NA基因与A/aquaticbird/Korea/KN-1/04株的相似性最高。2株H3N8禽流感病毒位于同一分支,同源关系较近。2株H3N8禽流感病毒的HA推导的氨基酸剪切位点序列均为P-E-K-Q-T-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列。

H1N2亚型猪流感病毒HA、NP、NA、M和NS基因的克隆与序列分析

对3株H1N2亚型猪流感病毒（SIV）：Sw／GX／17／05、Sw／HN／I／05和Sw／GX／13／06的血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M）和非结构蛋白（NS）基因进行克隆和序列分析。结果显示：3株分离毒株HA、NP、NA、M和NS基因之间核苷酸同源性分别为91．3％～98．0％、98．4％～98．8％、97．4％～98．3％、98．8％～99．8％和98．1％～98．4％。遗传进化分析显示：分离毒株与美国分离的三源基因重排HIN2sIV具有较近的亲缘关系；在HA、NP、M和NS基因进化树中，3株分离毒株均位于古典H1N1亚型SIV群，在NA基因进化树中，3株分离毒株则位于人流感病毒群。HA和NA基因推导氨基酸序列分别与代表毒株古典H1N1SIVA／swine／Maryland／23239／1991（H1N1）和人H3N2流感病毒A／BuenosAires／4459／96（H3N2）比较分析显示：HA（95．4％～96．1％）和NA（96．6％～97．2％）具有较高的氨基酸同源性；糖基化位点、抗原位点和受体结合位点（HA）处氨基酸存在一定的差异，这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His+Mut+表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。

AIVF株HA和NA全基因的扩增及序列比较

根据禽流感病毒 ( AIV)各基因片段两端保守区序列设计锚引物 ,应用 c DNA末端快速扩增法获得了 AIV分离株 A/Chicken/Shanghai/F/98( H9N2 )的血凝素 ( HA)和神经氨酸酶 ( NA)全长基因。 1 5个毒株的 HA和 NA序列比较结果表明 :F株与 Chicken/Beijing/1 /94、Duck/Hong Kong/Y2 80 /97同源率较高 ,为 94.4%～ 97.4% ,但与香港人流感病毒 Hong Kong/1 0 73 /99、Hong Kong/1 0 74/99及 Quail/Hong Kong/G1 /97同源率较低 ,为 90 .3 %～ 91 .9%。F株与 Duck/Hong Kong/Y2 80 /97的 NA基因不但同源率高达 97.4% ,而且均在 2 0 5位核苷酸之后缺失 9个核苷酸。另外 ,3 0个毒株的 HA基因 c DNA比较结果显示 ,最后

10株H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的10株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本试验分离到的10株病毒的HA和NA基因变异程度不大,变异概率大;在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类CBJ194亚分支,与CBJ194的HA基因核苷酸同源性在88.8%~95.8%,NA基因核苷酸同源性在93.4%~97.6%,可能与CBJ194由同一毒株进化而来。由于基因突变使ACHB101毒株的HA基因出现了新的糖基化位点,ACHN102毒株的保守受体结合位点发生变异。NA基因推导氨基酸序列中第63、64、65位有T、EI、3个氨基酸的缺失,导致61位糖基化位点的丢失。唾液酸吸附位点上有明显的突变。HA和NA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。

福建省2009年甲型H1N1流感病毒NA基因特征及对达菲的耐药性

目的监测福建省甲型H1N1流感病毒NA基因的变化以及对达菲的耐药情况,为临床诊疗和疾病控制提供参考依据。方法从福建省流感监测网络中随机选取23株甲型H1N1流感病毒,经病毒核酸提取和一步法RT-PCR扩增,获得NA基因片段,双向测定核苷酸序列,分析NA基因序列和重要氨基酸位点特征。结果 23株甲型H1N1流感病毒NA片段基因与A/California/07/2009(H1N1)代表株的核苷酸序列进行比较,同源性高达98.1%以上;23株毒株NA蛋白第275位氨基酸均为组氨酸。结论随机选取的23株甲型H1N1流感病毒NA基因片段保持高度同源并且对达菲仍然敏感。随着国内外达菲耐药株的不断出现,应加强耐药性监测,为制定应对甲型H1N1流感流行措施提供参考。

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。

宠物鸟H3N8亚型流行性感冒病毒NA基因分子特征性分析

虽然流行性感冒(流感)病毒的自然宿主是野生水禽类,作为宠物的雀形目鸟(Passeriformes)不代表流感病毒主要储存库[1-4,6,7],但Stallknecht和Shane 1988年对21 318份鸟的样品分析后发现,雀形目鸟中流感病毒的分离率占2.9%,表明雀形目鸟在流感病毒储存库中起着一定的作用.

2013年南京市甲型H1N1流感病毒NA基因的进化分析

目的 :调查2013年南京地区新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的分子特征,了解NA基因的变异情况,分析NA基因进化特征。方法:提取18株新型H1N1流感病毒基因组RNA,RT-PCR扩增NA基因,测序并分析其遗传进化特征和重要功能位点。结果:2013年南京分离株与国内外推荐疫苗株NA基因高度同源,序列相似性达98.2%以上。18株分离株在进化树上分为2支,与国内疫苗株接近,与国际疫苗株存在一定的遗传距离;与国内外疫苗株相比,多个位点氨基酸发生变异;1株分离株的酶活性位点119位发生了变异;部分分离株糖基化位点也出现了增加和缺失的现象。结论:南京市2013年流行株与国内外疫苗株NA基因同源性仍然较高,疫苗依然有效。2013年后期的甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因累积了更多的变异,需加强监测。