NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化

为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ,全反式维甲酸(ATRA)作用 0 ,12 ,2 4小时后每 μg总RNA中WT1基因的分子数分别为 4× 10 6,1.5 6× 10 6和0 .4× 10 6,与CD11b的变化情况相一致。结论提示 ,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关 。

新维甲酸类药物SX-115和CHU-012对NB4细胞系作用及其机制的初步研究

本研究通过应用细胞增殖、形态学、细胞周期动力学、NBT还原试验、表面分化抗原检测、免疫荧光分析和RT PCR等方法 ,观察新维甲酸类化合物SX 115和CHU 0 12对早幼粒细胞白血病细胞系NB4的作用。研究结果发现 ,SX 115和CHU 0 12在 10 -6 mol L时对NB4细胞有诱导分化作用 ,与同浓度的全反式维甲酸 (ATRA)相比 ,三者作用无明显差异 。

三氧化二砷对NB4及Jurkat细胞系端粒酶活性的抑制效应

为了探讨三氧化二砷 (As2 O3 )对白血病细胞系NB4及Jurkat细胞端粒酶活性的调节作用和机制 ,采用MTT、基因组DNA电泳、蛋白 /DNA双参数流式细胞术 ,端粒重复扩增 (TRAP) SYBRGreenⅠ染色及RT PCR等方法研究了As2 O3 对两种细胞的增殖及端粒酶活性的影响。研究发现 ,随着As2 O3 作用时间的延长 ,NB4及Jurkat细胞增殖明显受到抑制 ,DNA电泳出现“梯状”条带 ;流式细胞术检出亚G1峰 ,细胞周期阻滞于G1和G2 /M期 ,端粒酶活性显著降低 ,部分细胞周期及凋亡相关的调控蛋白的表达发生变化。结论 :As2 O3 在抑制NB4及Jurkat细胞增殖和诱导其凋亡过程中导致端粒酶的活性下调 ,细胞周期及凋亡相关蛋白的表达改变可能参与了部分作用机制。

三氧化二砷与维甲酸联合作用在NB4,MR2细胞系中的体外研究

目的 观察三氧化二砷 (As2 O3)和全反式维甲酸 (ATRA)联合作用对NB4 ,MR2不同亚型急性早幼粒白血病细胞株 ,诱导分化、增殖、凋亡的影响。方法 以NB4 ,MR2为体外模型 ,利用细胞生长曲线、台盼蓝拒染法、MTT法、NBT、细胞形态Wrigh’s Gimesa染色 ,观察细胞增殖、分化、凋亡的相互作用。结果 NB4细胞株 :0 .5 μmol LAs2 O3与 10 - 6 mol LATRA对细胞增殖、分化、凋亡呈现拮抗 ,而 0 .5 μmol LAs2 O3与 (10 - 7～ 10 - 8mol L)ATRA呈现协同 ;MR2细胞株 :0 .5 μmol LAs2 O3与 10 - 6 mol LATRA对细胞增殖、分化、凋亡呈现协同。结论 As2 O3与全反式维甲酸协同效应呈现不同细胞、剂量的特异性 ,MR2细胞株协同效应明显强于NB4细胞株。

新维甲酸类药物SX-116对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4的诱导凋亡作用

本研究通过应用细胞增殖、形态学变化、细胞周期动力学、DNA电泳和RT PCR等方法 ,观察新维甲酸类化合物SX 116对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4的作用。研究结果发现SX 116在 10 -6 mol L浓度条件下能引起NB4细胞凋亡 ,凋亡相关基因bcl 2在药物作用 6小时表达减弱 ,随着作用时间延长其表达量又回升至原有水平 ;另一凋亡相关基因 p5 3在药物作用过程中表达无变化。新维甲酸类化合物SX

二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4的作用及机制探讨

本研究旨在探讨二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞生物学特性的影响及可能的作用机制。采用不同浓度的二甲双胍处理NB4细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过细胞黏附实验分析药物对细胞黏附能力的影响。采用细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化抑制剂U0126预处理NB4细胞,Western blot观察ERK磷酸化水平的变化,同时检测细胞凋亡和黏附能力的改变。结果表明,二甲双胍能抑制NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡,增强细胞的黏附能力。5μmol/L U0126预处理有效抑制NB4细胞中ERK的磷酸化,降低5 mmol/L二甲双胍诱导的细胞凋亡并减弱细胞的黏附能力。结论:二甲双胍对NB4细胞有抑制增殖、促进凋亡和黏附的作用,MEK/ERK信号通路可能是二甲双胍在NB4细胞中的分子作用机制之一。

南瓜蛋白联合常用化疗药对NB4细胞增殖和凋亡的影响

本研究旨在探讨南瓜蛋白(CUS)与全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(ATO)联用对人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响。以MTT比色法检测CUS与ATRA或ATO联用对NB4细胞的增殖抑制作用,用流式细胞术检测CUS与ATRA或ATO联用对NB4细胞凋亡的影响,用金氏公式判断两药联用的协同效果。结果表明,CUS与ATRA或ATO联合应用的抑制率均大于各药相应浓度单用的抑制率,其协同指数q值均>0.85,并且两药均在低浓度范围内联用的协同效果明显。CUS与ATRA或ATO联合应用时NB4细胞的凋亡率均大于各药相应浓度单用时的凋亡率,其协同指数q值均>1.15。结论:CUS与ATRA或ATO联用对NB4细胞增殖和诱导凋亡均有较好的协同作用。

VPA联合As_2O_3对NB4细胞VEGF、NF-κB和MMP-9表达的影响

目的探讨丙戊酸钠联合As2O3对NB4细胞系血管内皮生长因子(VEGF)、核因子-κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响。方法实验分对照组、As2O3组、VPA组和As2O3联合VPA组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,以RT-PCR方法检测VEGF、NF-κB和MMP-9 mRNA的表达,以Western-blot方法检测VEGF、NF-κB和MMP-9蛋白的表达。结果 VPA增加As2O3诱导NB4细胞系存活率下降,NB4细胞在As2O3作用下VEGF、NF-κB和MMP-9表达增高(P<0.05)。联合VPA组3者表达均比单用As2O3组降低(P<0.05)。结论VPA可下调As2O3引起的VEGF、、NF-κB和MMP-9表达增高。

维甲酸、三氧化二砷诱导NB4细胞TRAIL基因表达的研究

目的:研究全反式维甲酸(ATRA)或三氧化二砷(As_2O_3)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的表达及其治疗APL的机制。方法:采用RT-PCR检测TRAIL基因表达的变化。结果:10^(-6)mol/L的ATRA作用6h或10^(-6)mol/L的As_2O_3作用12h、即可诱导TRAIL基因表达。结论:ATRA或As_2O_3能诱导NB4细胞TRAIL基因表达,TRAIL基因可能以类似“旁分泌”的作用方式杀伤NB4细胞。诱导TRAIL基因介导的细胞凋亡可能是ATRA或As_2O_3治疗APL的机制之一。

二氢鞘氨醇联合佛波酯增强NB4细胞中miRNA-21的表达

为了研究二氢鞘氨醇（Sphingonine，SA）和佛波酯（12一◇Tetradecanoylphorbol 13-acetate，TPA）联合使用后对人早幼粒白血病细胞NB4的生物学影响，利用四唑盐（3-（4，5-Dimethylthiahiazol-2-yl）-2，5-diphenytetrazolium bromide，MTT）比色法、流式细胞术和实时定量PCR等方法检测了细胞形态、生长凋亡和肿瘤相关基因miRNA-21的表达变化情况．结果显示，SA2．15mmol·L-1＋TPA10nmol·L^-联合用药组与TPA10nmol·L^-1单独处理组相比，细胞出现体积变小、膜皱缩和出芽等明显凋亡特征；SA2．15mm01·L^-1＋TPA10nmo·L^-1联合用药组细胞生长抑制率和凋亡率均明显高于SA或TPA单药组（P〈0．05）；miRNA-21成熟体和初级转录本的表达在SA2．15mmol·L^-1＋TPA10nmol·L^-1联合用药组均比SA或TPA单药组高2～4倍（P〈0．05）．结果表明sA联合TPA能显著增强抗白血病效应，其作用机制与miRNA-21的诱导表达相关．

葡萄球菌肠毒素A联合PML-RARα多肽刺激特异性T细胞杀伤NB4细胞株的作用(英文)

Objective:To investigate the effects of staphylococcal enterotoxin A (SEA) on the cytotoxicity of T cells stimulated by PML-RARα peptide in vitro. Methods: Peripheral blood mononuclear cells (MNC) from healthy donor were obtained by density gradient centrifugation on Ficoll-Hypaque,MNC were cultured with PML-RARα peptide and SEA for 20 days. After induction,the cytotoxicity of T cells induced against NB4 and K562 cell lines were examined by Cell Counting Kit-8 (CCK-8). The CD4 and CD8 surface markers on the harvested CD3+ T cells were detected by flow cytometry (FCM). Results: The cyto-toxicity of T cells induced by PML-RARα peptide with SEA was higher than that of T cells induced only by PML-RARα peptide against NB4 cells. The FCM assay showed that the ratio of CD4+/CD8+ T cells were gradually decreased in both groups of PML-RARα peptide whether with SEA or not at the intervals of day 5,10 and 20 day after induction,but the most significantly decreased by PML-RARα peptide with SEA. Conclusion: The specific cytotoxicity of T cells induced by PML-RARα peptide against NB4 cells could be enhanced with superantigen SEA.

Effect of realgar on telomerase activity and hTERT-mRNA expression in NB4 cells

Objective: To evaluate whether realgar could down-regulate human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene expression and telomerase activity in acute promyelocytic leukemia cell line-NB4 cells. Methods: The expression of hTERT-mRNA was analyzed by semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Telomerase activity was determined by polymerase chain reaction enzyme-linked immunoassay (PCR-ELISA). Flow cytometry using PI staining was applied to analyze the cell cycle and apoptosis. Results: Treatment of NB4 cells with 155, 300, 600 μg/L realgar reduced telomerase activity significantly accompanying with decrease of hTERT-mRNA and increasing cell apoptosis. G2/M phase arrest appeared when treated with realgar in 300, 600 μg/L. Conclusion: It is suggested that telomerase activity of NB4 cells can be specifically inhibited by realgar through the down-regulation of hTERT gene expression. G2/M phase arrest and apoptosis by realgar in NB4 cells might be related to the reduction of telomerase activity and hTERT-mRNA expression.

毫米波辐射对急性早幼粒白血病细胞增殖及分化的影响

目的：探讨毫米波（millimeter wave）对急性早幼粒白血病细胞增殖及分化的影响。方法：将体外培养的NB4细胞株接种于培养瓶，24小时后应用波长7．1mm、功率密度分别为1mW／cm2和5mW／cm2的毫米波辐射培养细胞30分钟，连续4天，每天观察细胞形态及数量改变，流式细胞术测定细胞增殖分化相关基因p53、p21、c－myc、c－fos及TGF－β1表达的改变。结果：1mW／cm2和5mW／cm2毫米波辐射能明显抑制NB4细胞增殖，辐射4天后的抑制率分别为35．6％和25．8％，1mW／cm2毫米波可诱导NB4细胞向终末细胞分化，诱导分化率为45．0％，主要为中、晚幼粒细胞；流式细胞术分析发现，经1mW／cm2毫米波辐射后，NB4细胞增殖分化相关基因p53、p21、c－fos表达增加，而c－myc和TGF－β1表达降低。结论：毫米波辐射能抑制体外培养的NB4细胞增殖并诱导其分化，作用机制可能与调控细胞增殖、分化相关基因的表达有关。

甲异靛对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB_4体外作用的研究

目的探讨甲异靛对NB4细胞系的抑制增生、诱导凋亡和分化的作用。方法用锥虫蓝染色方法进行活细胞计数;用NBT还原实验和CD11a、CD11b的表达判定促分化作用;光镜和电镜细胞形态学、TUNEL标记和Sub-G1测定观察细胞凋亡,RT-PCR和流式细胞术分析法检测凋亡调控基因mRNA及蛋白水平表达。结果20μmol/L和30μmol/L甲异靛可明显抑制NB4细胞的增生,诱导细胞凋亡并下调bcl-2表达,使细胞停滞在G0/G1期。5μmol/L和10μmol/L时NB4细胞的NBT还原能力明显升高,CD11a表达明显升高。结论甲异靛通过诱导细胞凋亡和使细胞停滞在G0/G1期这两种机制显著抑制NB4细胞增生,此外,还有部分诱导细胞分化的作用。

人脐带间充质干细胞对白血病细胞增殖分化的作用

目的:探讨人脐带间充质干细胞对急性髓系白血病M3型细胞NB4细胞系增殖分化的影响及其相关机制。方法:分离及培养HUC-MSC细胞和NB4细胞,建立以HUC-MSC细胞为基质细胞、NB4细胞为目的细胞的直接共培养体系。应用CCK-8法和细胞计数法检测细胞增殖情况;应用瑞氏吉姆萨染色和NBT还原实验检测细胞分化状态;应用ELISA法检测各组上清中IL-6表达水平;应用实时定量PCR技术检测IL-6相关基因CDKN1A、CCND1、Survivin、STAT3的转录水平。结果:两种细胞共培养后在倒置显微镜下可见到共生良好。与正常NB4细胞相比,同HUC-MSC共培养的NB4细胞的增殖能力减弱;HUC-MSC能促进ATRA诱导的NB4细胞分化。在共培养组上清中IL-6水平显著升高。与单纯培养的NB4细胞相比,共培养组和ATRA诱导组的NB4细胞中细胞周期素D1基因(CCN D1)转录水平均不同程度下降(NB4:NM:NA:NMA=1:0.35:0.70:0.20),CDKN1A表达水平不同程度增高(NB4:NM:NA:NMA=1:3.21:1.41:5.32)。结论:间充质干细胞可能通过IL-6信号通路抑制NB4细胞的增殖,促进ATRA诱导的NB4细胞的分化。

丹参酮ⅡA与三氧化二砷协同诱导急性早幼粒白血病细胞凋亡的研究

目的研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)与三氧化二砷(ATO)联合对急性早幼粒白血病细胞(NB4)分化以及凋亡有无协同作用。方法用TanⅡA联合ATO作用于NB4细胞。观察药物作用不同时间段的活细胞数,计算实验各时段的生长抑制率;Giemsa染色与透射电镜观察细胞形态学变化;流式细胞术Annexin V法测定细胞凋亡率,并进行细胞周期和细胞凋亡分析。结果①TanⅡA与ATO联合对NB4细胞生长有协同抑制作用,这种抑制作用随作用时间及联合ATO浓度的增加而增加。1.0μg/mL TanⅡA分别与0.125、0.25以及0.5μmol/LATO联合作用5 d对NB4细胞的生长抑制率均强于相应浓度ATO单独作用对NB4细胞的生长抑制率(P<0.01);②TanⅡA与ATO联合对诱导NB4细胞凋亡有协同作用。1.0μg/mL TanⅡA分别与0.5μmol/L和1.0μmol/L ATO联合作用NB4细胞1 d,NB4细胞的凋亡率分别比相应ATO单独用药组的促凋亡效应增强(P<0.05),TanⅡA与0.5μmol/L ATO联合的促凋亡协同效应持续3 d;③TanⅡA与ATO联合对NB4细胞增殖有协同抑制作用,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少。1.0μg/mL TanⅡA分别与0.125、0.25和0.5μmol/L ATO联合作用NB4细胞3 d的增殖指数(PI)均低于相应单药的PI值(P<0.05)。结论TanⅡA联合ATO对诱导NB4细胞凋亡有明显的协同作用,这种协同作用和联合使用的ATO的浓度密切相关;TanⅡA联合ATO对NB4细胞诱导分化未显示明显的协同作用。

胆固醇合成抑制剂洛伐他汀对NB4细胞体外作用的研究

目的 研究胆固醇合成抑制剂洛伐他汀 (Lovastatin ,LOV)对NB4白血病细胞增殖、凋亡、分化的影响。方法 以NB4白血病细胞为模型 ,用MTT比色法、锥虫蓝拒染法首先观察LOV对细胞增殖及活力的影响。通过细胞形态学观察、NBT还原试验、DNA凝胶电泳、流式细胞术细胞周期分析、TUNEL、RT PCR半定量测定bcl 2mRNA水平 ,系统观察LOV对NB4体外诱导分化和凋亡的情况。最后利用RT PCR半定量测定H、K、N ras基因表达水平 ,结合流式细胞术进行胞膜p2 1Ras蛋白测定 ,探讨LOV作用机制。结果 ①LOV抑制NB4细胞增殖 ,IC50 为 12 .5 9μmol L。②LOV诱导NB4细胞凋亡 ,影响细胞周期进程 ,细胞阻滞于G1 S期。LOV在诱导细胞凋亡过程中随作用时间延长 ,bcl 2表达水平逐渐下降。③LOV不影响NB4细胞分化。④LOV作用于NB4细胞 ,H、K、N ras基因转录水平无变化 ,但膜表面p2 1Ras蛋白水平随时间进行性下降。结论 LOV抑制NB4细胞增殖并诱导凋亡 ,使细胞周期进程阻滞于G1 S期。bcl 2参与了LOV诱导NB4细胞凋亡的基因调控。LOV对NB4细胞分化无影响。p2 1Ras蛋白异戊二烯化受抑而阻滞p2 1Ras蛋白定位于细胞膜上可能是LOV影响NB4细胞的主要机制。

抗PML-RAR_α反义核酸的设计、合成和对NB4细胞生长、凋亡的影响

目的合成针对长型ＰＭＬＲＡＲα融合基因ｍＲＮＡ起始部位和融合位点的反义核酸（ＡＳ），探讨ＡＳ的稳定性、特异性及其对ＮＢ４细胞生长、凋亡的影响。方法以ＮＢ４细胞株为研究对象，采用台盼蓝拒染法进行细胞计数；聚丙烯酰胺凝胶进行寡核苷酸的电泳；流式细胞仪、ＤＮＡ电泳、细胞荧光染色进行细胞凋亡检测。结果合成的ＡＳ稳定、耐细胞内外核酸酶、无非特异性作用；起始部位ＡＳ（ＳＴＡＳ）和融合位点ＡＳ（ＦＵＡＳ）明显抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性。浓度２０μｇ／ｍｌ时增殖抑制率０％～１１．３％；８０μｇ／ｍｌ时，抑制率５０．０％～６７．７％。ＦＵＡＳ（６０μｇ／ｍｌ）处理第７天、第９天出现明显的凋亡细胞群，处理后３天、５天、７天、９天的凋亡细胞率分别为９．３％、２４．５％、４１．０％、３４．２％。结论针对长型ＰＭＬＲＡＲα融合基因的ＡＳ设计、合成是成功的；抗ＰＭＬＲＡＲαＡＳ能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

抗PML-RAR_α反义核酸对NB4细胞形态、PML-RAR_α mRNA及蛋白质表达的影响

目的探讨抗ＰＭＬＲＡＲα反义核酸（ＦＵＡＳ）对ＮＢ４细胞的分化、ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达及ＰＭＬ／ＰＭＬＲＡＲα蛋白细胞内定位的影响。方法以ＮＢ４细胞为研究对象，细胞形态观察采用Ｗｒｉｇｈｔ染色法；ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达采用ＲＴＰＣＲ法；ＰＭＬ／ＰＭＬＲＡＲα蛋白细胞内定位采用免疫荧光技术。结果ＦＵＡＳ处理后第５天，细胞出现部分分化。处理后２４，７２，１２０小时，ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达分别下降５２．０％、６８．７％、２３．４％。抗ＰＭＬ抗体免疫荧光检测，ＦＵＡＳ处理２４小时后，细胞内微小颗粒消失，残存颗粒变大，１２０小时细胞内颗粒几乎消失。结论ＦＵＡＳ特异性阻断ＰＭＬＲＡＲαｍＲＮＡ表达，使ＰＭＬＲＡＲα融合蛋白合成减少甚至消失。

RNA干扰I2PP2A基因表达对NB4-R1细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨沉默蛋白磷酸酯酶抑制因子-2（I2PP2A）基因表达对人急性早幼粒细胞白血病（APL）维甲酸耐药细胞株NB4-R1增殖和凋亡的影响.方法 设计、构建靶向I2PP2A基因的RNA 干扰慢病毒载体I2PP2A-shRNA,在聚凝胺（polybrene）介导下转染NB4-R1细胞,用实时定量RT-PCR（qRT-PCR）和Western blot法检测转染前后I2PP2A表达水平;CCK-8比色法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡比例;Western blot法检测caspase-8及PARP蛋白表达水平.结果 qRT-PCR和Western blot结果显示I2PP2A-shRNA转染组I2PP2A基因表达水平均明显下调,I2PP2A mRNA表达水平较空白对照组和阴性对照组分别下调（70.0±9.6）％和（64.0±6.2）％（P＜ 0.05）;I2PP2A蛋白表达水平下调幅度与mRNA一致.CCK-8增殖实验结果显示I2PP2A-shRNA转染组NB4-R1细胞增殖率比空白对照和阴性对照组均明显降低（P＜0.05）.流式细胞术检测结果显示I2PP2A-shRNA转染组较空白对照组和阴性对照组细胞凋亡率分别增加了（6.30±0.67）倍和（6.04±0.56）倍（P＜0.01）;封闭I2PP2A基因表达后caspase-8和PARP前体蛋白表达较空白对照组分别降低（44.0±3.1）％和（57.0±4.0）％（P＜0.05）,而caspase-8 （p43）和PARP（p89）剪切体蛋白表达则较空白对照组分别增加了（36.0±2.5）％和（45.0±4.8）％（P＜ 0.05）.结论 利用RNA干扰技术沉默I2PP2A基因表达可以显著抑制NB4-R1细胞增殖并促进NB4-R1细胞凋亡,其机制可能与激活caspase-8,启动外源性细胞凋亡通路密切相关.