新型含氮双氢青蒿素二聚体对人白血病细胞株NB4-R1细胞凋亡的影响

目的:探讨新型水溶性含氮双氢青蒿素二聚体SM 1044对全反式维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4-R1细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法:流式细胞术检测SM 1044对细胞凋亡、线粒体跨膜电位以及细胞活性氧(ROS)水平的影响,Western blot检测SM 1044对MAPK(ERK、JNK)信号通路以及PML/RARα融合蛋白的影响和凋亡相关蛋白表达的变化。结果:SM 1044能够显著诱导NB4-R1细胞发生细胞凋亡以及线粒体跨膜电位丢失,同时能活化凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9以及抗多腺苷二磷酸核糖聚合酶;SM 1044可诱导NB4-R1细胞产生ROS;Western blot检测结果显示,SM 1044能够激活MAPK(ERK、JNK)信号通路的磷酸化,同时下调PML/RARα融合蛋白的表达。结论:SM 1044能够诱导全反式维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4-R1细胞凋亡,其诱导凋亡可能与ROS/ERK以及ROS/JNK信号通路有关,此外,SM 1044也可通过下调PML/RARα融合蛋白诱导细胞凋亡。

沉默SET基因对急性早幼粒白血病NB4-R1细胞的作用

目的:探讨沉默SET基因对耐维甲酸急性早幼粒白血病NB4-R1细胞生物学特性的影响。方法:将含SET基因特异shRNA干扰序列的慢病毒载体pGCSIL,与其他包装质粒在293T细胞中包装成具有感染性的慢病毒质颗粒。收集并浓缩慢病毒,转染体外培养的NB4-R1细胞并建立稳定转染的细胞株。用荧光实时定量PCR和蛋白凝胶电泳Western blot验证转染后SET基因在NB4-R1细胞中的干扰效率,并检测沉默SET基因对蛋白磷酸酶PP2A表达的影响。用流式细胞术分析沉默SET基因前后NB4-R1细胞周期的变化。结果:与对照组相比,实验组SET基因的表达被有效抑制,PP2A表达增高。沉默SET基因导致NB4-R1细胞G_0/G_1期明显增加,S期细胞比例明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:利用慢病毒靶向干扰SET基因的表达可以使PP2A表达增高,并扰乱NB4-R1细胞的增殖周期。本研究为进一步研究SET相关的急性早幼粒细胞白血病临床靶向治疗奠定实验基础。

四硫化四砷诱导维甲酸耐药的急性早幼粒白血病NB4-R1细胞凋亡及其分子机制

目的:探讨四硫化四砷(As4S4)对维甲酸耐药的NB4-R1细胞诱导凋亡的作用及其机制。方法:As4S4作用于NB4-R1细胞0、24、48 h后,收集细胞,按照不同的处理时间分为对照组和实验组。应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解断裂条带,蛋白凝胶电泳Western blot方法检测药物作用NB4-R1细胞后BCL-2、BAX和Caspase-3蛋白的表达。结果:25μmol/L As4S4作用0、24和48 h后,NB4-R1细胞早期凋亡率由0%升至24.49%和47.41%,晚期凋亡率由0.08%升至14.72%和20.70%,细胞凋亡呈现时间依赖性。应用As4S4处理24 h后可以观察到凋亡细胞DNA降解形成的明显的梯形条带。细胞周期分析发现,25μmol/L As4S4能使NB4-R1细胞阻滞于S期,药物作用24 h及48 h后,S期细胞由31.85%升高至42.53%及55.12%,G0/G1期细胞由57.30%降至了37.56%及28.51%。Western blot检测发现,As4S4作用NB4-R1细胞48 h后,BAX表达上调,BCL-2表达下调,Caspase-3出现活化条带。结论:As4S4能有效的诱导NB4-R1细胞凋亡,并通过影响BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白表达,触发线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。

构建雄黄诱导维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病NB4-R1细胞凋亡的蛋白质双向电泳图谱

目的构建雄黄(四硫化四砷,tetra-arsenic tetra-sulfide,As4S4)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞凋亡前后的差异蛋白质组表达谱。方法 首先应用MTT法、透射电镜、AnnexinV/PI双染法和激光共聚焦显微镜的一系列体外实验定性化和定量化雄黄诱导NB4-R1细胞凋亡的作用;然后应用高分辨二维双向电泳技术构建雄黄诱导维甲酸耐药细胞株NB4-R1凋亡前后的差异蛋白质组表达谱。结果 雄黄对NB4-R1细胞的生长抑制效应呈剂量和时间依赖性,雄黄作用24h半数抑制浓度(IC50)为(24.06±0.19)μmol/L,48h IC50为(9.50±0.13)μmol/L,72h IC50为(6.55±0.03)μmol/L;确定了25μmol/L雄黄作用24h和48h时分别为NB4-R1细胞凋亡主群的早期和凋亡晚期阶段;成功构建了雄黄诱导维甲酸耐药细胞株NB4-R1凋亡前后的差异蛋白质组表达谱,ImageMasterTM2D Platinum图像分析软件分析显示,未处理组(R0)、处理24h组(R24)和处理48h组(R48)的蛋白质组表达图谱分别平均含1069、975和893个点;R24与R0的匹配率为79.94%,R48与R0的匹配率为69.33%,R24与R48的匹配率为71.91%。结论 成功构建雄黄诱导维甲酸耐药细胞株NB4-R1凋亡前后的差异蛋白质组表达谱,为今后从整体上更好地理解雄黄诱导耐药APL细胞凋亡的蛋白质组传导网络以及筛选恶性血液肿瘤新型生物标志物和药物靶标方面奠定了基础。

葛根总黄酮联合三氧化二砷体外诱导NB4-R1细胞凋亡的实验研究

目的:探讨葛根总黄酮联合三氧化二砷(As2O3)对维甲酸耐药细胞株NB4-R1增殖及凋亡的影响。方法:采用葛根总黄酮(0、10、30、50μg/mL)联合As2O3(1μmol/L)处理NB4-R1细胞24、48、72 h,MTT法检测细胞增殖抑制率;光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态改变;流式细胞仪检测细胞周期变化;FITC-AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。结果:(1)一定浓度葛根总黄酮对NB4-R1细胞生长有抑制效应,呈剂量和时间依赖性,相同条件下,葛根总黄酮联合1μmol/L As2O3对NB-R1细胞抗增殖作用强于单用葛根总黄酮,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)FITC-Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡结果发现葛根总黄酮(0、10、30、50μg/mL)及葛根总黄酮联合1μmol/L As2O3处理NB4-R1细胞48 h后,早期凋亡率呈浓度依赖,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)瑞氏染色,在光镜下观察到葛根总黄酮和葛根总黄酮+As2O3联用组呈现不同程度的细胞凋亡形态学特征,且联用组较单药组明显。(4)流式细胞术检测细胞周期变化发现葛根总黄酮和葛根总黄酮+As2O3联用可影响细胞进程,表现为S期细胞增多,葛根总黄酮+As2O3联用组比各单用葛根总黄酮组Sub-G1增加更为明显。(5)Western blottimg结果显示葛根总黄酮可上调NB4-R1细胞中JNK表达,下调ERK1/2表达。结论:低浓度葛根总黄酮体外对维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞具有增殖抑制作用,呈时间-浓度依赖性,与1μmol/L As2O3具有协同作用;其诱导凋亡作用机制可能为阻滞NB4-R1细胞周期进程,激活JNK途径,下调ERK通路。

过表达prohibitin促进NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡

目的构建人prohibitin基因真核过表达载体,探讨上调prohibitin对NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡的影响。方法 PCR钓取目的基因prohibitin,与pEGFP-N1-3FLAG真核载体定向连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将阳性重组载体pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin转染NB4-R1细胞,以实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测过表达效果,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测prohibitin过表达对NB4-R1细胞凋亡的影响。结果 PCR筛选及测序比对,证明成功构建了prohibitin基因过表达载体;对NB4-R1细胞转染率可达70%以上;qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin过表达载体组(OE)prohibitin mRNA表达水平较空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)分别上调(1.64±0.37)倍和(1.58±0.43)倍(P<0.05),Western blot结果显示OE组prohibitin蛋白表达水平较CON组和NC组分别上调(1.91±0.33)倍和(1.99±0.37)倍(P<0.05);流式细胞术结果表明CON组、NC组和OE组NB4-R1细胞凋亡率分别为(5.88±0.43)%、(6.63±0.46)%和(28.22±1.33)%,OE组较CON组和NC组细胞凋亡率分别增加了(3.80±0.24)倍和(3.39±0.30)倍(P<0.05)。结论过表达prohibitin可诱导NB4-R1细胞凋亡。

干扰素联合全反式维A酸逆转NB4-R1细胞的耐药机制研究

目的:探讨干扰素(IFN)联合全反式维A酸(ATRA)逆转维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病(APL)的机制。方法:取指数生长期的NB4-R1细胞分为6组,分别加入ATRA、IFN-α、IFN-γ、IFN-α+ATRA、IFN-γ+ATRA(其中ATRA终浓度为2μmol/L,IFN-α和IFN-γ终浓度均为1 000IU/ml),以及不加药组的空白对照组,用MTT法检测细胞的增殖状况;蛋白免疫印迹试验测定各组NB4-R1细胞2hIRF-1蛋白表达,以及IFN-α+ATRA组、IFN-γ+ATRA组诱导NB4-R1细胞观察8hIRF-1蛋白表达的差异。结果:除ATRA组外,另外4个实验组均对NB4-R1细胞增殖有抑制作用,且联合用药的效果明显高于单独用药;5个实验组IRF-1蛋白均有表达,IFN-α+ATRA组、IFN-γ+ATRA组明显高于其他3组;IFN-α+ATRA组和IFN-γ+ATRA组比较,2h内前者IRF-1蛋白表达量逐渐下降,而后者则无明显变化;至用药8h后,IFN-α+ATRA组IRF-1蛋白表达基本消失,而IFN-γ+ATRA组的表达量仍较前无明显变化。结论:ATRA联合2种干扰素诱导NB4-R1细胞分化均有作用,但ATRA+IFN-γ效果更加显著;而IFN-α+ATRA组与IFN-γ+ATRA组比较,前者作用维持时间更长,可能与IRF-1蛋白持续表达有关。