杏NBS基因家族鉴定及其对果实抗病性的影响

【目的】探讨杏果实发育过程中NBS基因家族的表达规律,为果实抗病机制研究提供理论指导。【方法】运用生物信息学方法进行NBS基因家族鉴定与转录组分析。【结果】在串枝红杏基因组中共鉴定到155个NBS抗病基因,主要分为CNL型(126个)和NL型(29个),45%的基因主要分布在1号与2号染色体上,顺式作用元件较多且大多属于激素调控元件,发现1个杏特有的基序CNBS-1。NBS基因在不同品种发育过程中的基因表达模式类似,但在表达量上存在较大差异。8个NBS基因在串枝红果实发育的4个时期表达量均显著高于同时期大白杏,表明这些基因可能与串枝红果实抗病性高于大白杏有关。【结论】获得8个NBS差异表达基因,主要与抗致病疫霉病原与霜霉病原有关,为杏果实抗病育种提供理论指导。

响应白粉菌的小麦NBS基因筛选

核苷酸结合位点(NBS)基因是植物中广泛存在的一类抗病基因,通过分析小麦NBS基因受白粉菌侵染后的表达水平变化情况,可为小麦育种筛选抗白粉病相关基因。试验采用生物信息学方法,对小麦抗病品种受白粉菌侵染0,24,48,72 h的转录组原始数据进行组装,结果筛选出1283条具有表达数据的TaNBS,其在21个染色体均有分布。表达差异分析结果表明,有395条TaNBS受白粉菌侵染后的表达水平变化显著;根据3个时间段(0~24 h,24~48 h,48~72 h)内的变化趋势将其分为降-升-升、升-升-降、升-降-升、降-降-升和升-升-升共5类。利用qRT-PCR技术,从升-升-升类中选择10个变幅最大的TaNBS进行验证,结果表明,有3个基因Ta7dlLoc004854、Ta7dlLoc000139和Ta3asLoc007663在实验室自育小麦抗病种质CH7124中受白粉菌侵染后保持显著上调;利用病毒诱导基因沉默技术,分别下调了上述3个基因在CH7124中的表达水平,获得沉默植株;接种鉴定试验结果表明,只有Ta7dlLoc000139的沉默植株对白粉菌的感染型由免疫变为高抗或中抗,说明Ta7dlLoc000139表达水平的降低引起了植株抗性减弱。序列分析结果表明,Ta7dlLoc000139全长4042 bp,包含3个外显子和2个内含子,在其起始密码子前2000 bp区域内包含大量的CGCG-Box、GATA-Box和CAAT-Box等调控元件。可为小麦抗病分子育种提供理论依据。

玉米与其他六种植物NBS类抗病基因的进化比较分析

具有核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)的抗病基因在植物抵抗各种病原菌侵染中起关键作用。对玉米全基因组中具有NBS结构的基因进行鉴定和分析,并结合水稻、高粱、拟南芥、百脉根、苜蓿和杨树的NBS类基因比较其在数量、复制、染色体定位和亲缘关系上的进化差异。发现玉米NBS类基因数量、复制数和成簇基因数均明显少于其他植物。低复制频率可能导致玉米NBS类基因较少,并推测可能导致其功能具有多样性。在基因染色体定位上,除高梁外,玉米与其他五种植物相似,呈不均衡分布。此外,进化树分析表明玉米NBS类基因与高粱的亲缘关系最近,与拟南芥的最远,在物种间表现出较高的保守性。结果对掲示玉米NBS基因的进化特点与发掘有益的NBS类抗病基因提供了重要的理论依据。

三个苹果NBS基因的鉴定及其对外源生长物质的响应

为了探讨苹果NBS基因的生理作用,从苹果中鉴定了NBS家族的3个基因,分别命名为MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1。这3个基因编码的蛋白质均含有NB-ARC结构域,MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1蛋白N端还有TIR结构域,MdTIR-NBS-LRR1蛋白在C端含有LRR结构。荧光定量PCR分析表明,这3个不同类型的NBS基因的表达具有明显不同的组织特异性,此外,MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1在‘嘎啦’苹果幼苗叶片中均受SA和MeJA诱导。ACC处理不能提高MdNBS和MdTIR-NBS1基因的表达,但能诱导MdTIR-NBS-LRR1基因表达。结果表明,MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1基因可能参与了苹果抗逆或抗病防御反应。

绿豆C3H和NBS转录因子家族成员鉴定及盐胁迫响应分析

NBS和C_(3)H是植物体内2个重要的转录因子家族,在调控植物抗病与耐盐方面不可或缺。本研究通过转录组数据分析、qRT-PCR分析,分别鉴定出30个和289个绿豆C_(3)H和NBS家族成员,2个基因家族各有13个基因受到纯化选择,并且C_(3)H和NBS基因家族种内共线性关系均为片段重复。耐盐材料的转录组数据分析结果表明,VrC_(3)H5、VrC_(3)H7、VrC_(3)H10和VrC_(3)H13等4个基因的表达量在盐胁迫后发生显著改变。VrC_(3)H5,VrC_(3)H7和VrC_(3)H133个基因对脱落酸(ABA)处理、氯化钠(NaCl)处理、干旱胁迫都有不同程度的响应,VrC_(3)H5在ABA处理后基因表达量上调超过了10倍。在NBS基因中,有85个基因在盐胁迫10 d和15 d后出现显著差异表达,其中9个NBS基因表达变化值|log_(2)FC|(FC为表达倍数变化)大于2。VrNBS20转录因子通过调控EVM0022385参与绿豆的耐盐功能,VrNBS20可能是绿豆抗病与耐盐调控网络中的交叉点。本研究结果为绿豆耐盐与抗病研究提供了丰富的基因资源。

草莓NBS-LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析

利用同源克隆结合RACE技术从久香草莓茎尖cDNA中分离到一个抗病相关TIR-NBS-LRR类基因FaNBS1（GenBank登录号：HQ845018），解析了该基因及其编码蛋白的组织结构和同源特征；并采用半定量RT-PCR技术分析了该基因在不同组织中的表达差异和外源植物生长物质处理下的表达变化。该基因在基因组上长为2434bp，由3个外显子组成的转录本包含长1893bp的读码框。所编码蛋白含630个氨基酸残基，在15～146是保守的TIR结构域，191～492是NB-ARC结构域。FaNBS1与大豆TIR-NBS-LRR抗性蛋白ADF78118的全序列一致性为50．20％，在NB-ARC保守结构域的一致性为52．06％。半定量RT-PCR分析显示，FaNBS1在检测的所有组织中都表汰佃存摹套分年组织中表达水平最高,日存叶中的表达水平明显受到外源水杨酸和脱落酸处理的影响.

毛白杨NBS型基因PtDRG01原核表达研究

为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行优化与分析表明:最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目标蛋白,为PtDRG01基因编码蛋白的功能鉴定研究奠定了基础。

小麦全基因组NBS类R基因分析及2AL染色体NBS-SSR特异标记开发

NBS（nucleotide binding site）类基因是植物界中最重要的一类抗病基因。用信息学方法从普通小麦（Triticum aestivum L.）全基因组中分离出2406条含有NBS结构的完整蛋白序列,每条包含48~2272个氨基酸残基。根据NBS结构域两端是否连接CC或LRR结构域,将TaNBS分为N、CN、NL和CNL 4类。对TaNBS所在scaffold序列的SSR位点进行诊断,从1203条scaffold序列上发现2177个SSR位点,以二碱基重复位点最多,占73.5%。针对小麦2AL染色体上的51个SSR位点开发标记,缺体–四体和双端体验证结果表明,有39个标记（76.5%）为2AL特异标记,其中24个特异标记在抗白粉病材料Khapli（2AL上携带Pm4a）和感病材料Chancellor间存在多态性。利用近等基因系Khapli/8＊Cc筛选出3个可能与Pm4a连锁的NBS-SSR标记,分别是Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39和Sxaas_2AL46。本研究开发的与抗病序列紧密连锁的特异SSR标记可用于2AL染色体上抗病新基因的检测以及已有抗病基因的候选序列筛选。

樟树NBS-LRR类抗病基因家族分析与CcRNL基因克隆

樟树(Cinnamomum camphora L.Presl.)是自然界中较少受病原体侵害的优良抗性种质资源。利用生物信息的方法对樟树叶组织转录组数据中NBS类抗病基因进行了鉴定,对其编码的假定蛋白的理化性质、保守基序及系统发生关系等进行分析。结果表明,在樟树叶组织转录组中共找到28个具有完整编码框的NBS类抗病基因,大小在2 118-3 378 bp之间,编码蛋白等电点在5.35-9.03之间;在NBS区域内鉴定获得8个保守motifs,系统发育树将28个成员分为5个亚组。通过PCR法克隆获得2个RNL类抗病基因全长,分别命名为CcRNL1和CcRNL2,在氨基酸序列水平二者相似性为71%,在多肽N端都具有RPW8-like保守序列,暗示它们可能具有拟南芥RPW8基因所具有的广谱抗白粉病功能。采集感白粉病和正常樟树幼叶进行表达分析,结果显示CcRNL1可被樟树白粉病菌诱导表达,推测其可能参与了响应白粉病菌胁迫反应过程。

陆地棉CC-NBS-LRR基因的克隆及特征分析

根据抗病基因核苷酸结合位点(Nuc leotide b ind ing site,NBS)设计简并性引物,从陆地棉cDNA中进行RT-PCR扩增。获得含NBS保守域的EST,进一步用RACE技术和TAIL PCR技术获得其中1个EST的全长基因序列,并获得GHNBS基因的5′调控序列。此基因被命名为GHNBS。该基因的编码区长2 583 bp,编码861个氨基酸,GHNBS编码的氨基酸序列与拟南芥R基因具有28%的同源性。GHNBS与拟南芥的其他几个NBS-LRR基因比较发现,它们在保守区外的相似性相当低。Southern杂交和网上数据库搜索分析都表明GHNBS是1个寡拷贝基因。通过半定量RT-PCR分析发现GHNBS在棉花的蕾、花瓣、韧皮部、根及叶中均有表达且在根、叶中表达量比其它部位强,在木质部基本不表达。

小果野蕉(Musa acuminata)全基因组NBS抗病基因的鉴定与分析

为探讨小果野蕉(Musa acuminata)中NBS基因的功能,基于新近发表的小果野蕉全基因组序列,对NBS基因家族进行鉴定、分类和染色体定位,解析基因的复制特征、系统发育关系及上游启动子调控元件类别,推测这些基因在小果野蕉中可能的功能。结果表明,在小果野蕉全基因组中鉴定出125个NBS基因,包括78个标准和47个非标准NBS基因。多数NBS基因在染色体上以基因簇形式存在,串联复制是NBS基因家族扩张的主要动力。系统发育分析表明标准NBS基因形成两大分支,77个标准NBS基因有EST表达支持。这为群体水平的抗病基因型筛选提供了本底信息,促进栽培香蕉分子抗病育种进程。

黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2的克隆及VIGS验证

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源。为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN 2(GenBank ID:MK618462),测序全长为4303 bp,完整的编码框长度为4092 bp,编码1363个氨基酸残基,该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因,含有1个NB-ARC和2个LRR结构域,属于具有信号肽的可溶性蛋白。核苷酸相似性分析显示,CfRFN 2与其他瓜类NBS类基因相似性在87%~98%之间;系统进化树分析表明,CfRFN2蛋白和瓜类的其他NBS类抗病蛋白聚为一个分支,其中CfRFN2蛋白与中国南瓜和美洲南瓜的RPS2、印度南瓜的RPS2-like亲缘关系最近,其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220,与甜瓜的Atg27190亲缘关系相对较远;组织表达特性分析表明,CfRFN 2基因在黑籽南瓜叶片中表达量最高,其次是茎,而在果皮和根中表达量较低。该研究采用烟草脆裂病毒载体系统,构建了黑籽南瓜VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN 2,含沉默载体的农杆菌侵染黑籽南瓜幼苗后接种枯萎病菌,qRT-PCR检测表明,接种后2 d和4 d的转pTRV2-CfRFN 2沉默组植株的CfRFN 2基因表达量比接种后同时期的野生型植株显著降低(分别下降34.75%和98.27%),病情指数增加为野生型的1.32倍,初步证明黑籽南瓜CfRFN 2基因具有抗枯萎病的功能,推测该基因可能在黑籽南瓜抗枯萎病防御过程中发挥着重要作用。该研究中NBS类基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础,也为发掘黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供新信息。

乌拉尔图小麦全基因组NBS-SSR位点分析及标记开发

[目的]本研究旨在诊断乌拉尔图小麦NBS家族所在基因组序列的SSR位点,并为抗源的发掘和利用开发分子标记。[方法]利用NBS隐马模型文件检索数据库获得目标序列,通过软件诊断序列SSR位点并开发标记,利用乌拉尔图小麦抗白粉病材料UR207和感病材料UR203进行标记验证。[结果]本研究从乌拉尔图小麦全基因组中分离出463个NBS基因,分为N、CN、NL和CNL共4类。从NBS所在scaffold序列上发现4 292个SSR位点,以二碱基重复位点最多,占78.1%。随机开发了42个分布于各染色体臂的TuNBS-SSR标记,有12个标记在UR207和UR203间存在多态性。[结论]本研究从乌拉尔图小麦全基因组中诊断出4 292个NBS-SSR位点,开发的12个标记在抗感材料间有多态性,可用于乌拉尔图小麦材料抗病性鉴定和抗病基因筛选。

花生种皮中一种NBS类抗病基因的克隆与序列分析

利用植物抗病基因核苷酸结合位点(NBS)的保守区设计一对特异引物,以抗、感黄曲霉病花生品种J11和金花1012的种皮基因组DNA和RNA为材料进行DNA-PCR和RT-PCR扩增,经克隆、测序,得到一条504 bp的目的片段pnbs1,在GenBank上的登录号为GQ199610。Blast和Blastx分析发现pnbs1核苷酸序列与C8V1G10F抗性蛋白的核苷酸序列的同源性为89%,与抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性为59%。该片段的氨基酸序列中含有抗病基因NBS区域的3个保守模体:GPGGVGKTT、KKFFIVLDDVW和STILLTTR,推测pnbs1可能是花生NBS类抗性基因的核心区域。

亚麻NBS类抗病基因家族全基因组分析

亚麻基因组测序完成为全基因组水平分析抗病基因提供了前提条件，而NBS类抗病基因是植物中最大的抗病基因家族之一。本研究利用生物信息学方法对亚麻全基因组中NBS类抗病基因进行了鉴定，对NBS类抗病蛋白的理化性质、基因结构、保守基序及其系统发生荚系进行了分析。结果表明：在亚麻全基因组中共找到137个NBS类抗病基因，其中分子量大于100kDa序列比例在50％以上，等电点值在5～8的范围内比例为70．07％。系统进化树将NBS类基因分成7个亚组，且同一亚组内基因的结构和保守基序保持着较高的一致性。本研究的结果将为亚麻NBS类抗病基因家族的基因定位以及相关抗病基因克隆等深入研究提供参考。

突变型Nbs1基因转染对头颈癌化疗敏感性的影响

目的:探讨突变型Nbs1基因转染对头颈癌细胞化疗敏感性的影响。方法:用突变型Nbs1腺病毒载体转染头颈癌细胞株JHU006,同时给予顺铂处理,24 h后,用MTT法测定癌细胞生长曲线,中性彗星法检测癌细胞DNA双链断裂程度。结果:JHU006细胞株在转染突变型Nbs1基因加顺铂治疗后,细胞生长处于停滞状态,至第6天大部分细胞死亡;中性彗星实验显示,该组癌细胞平均尾力矩值明显增高。结论:突变型Nbs1基因转染可显著抑制头颈癌细胞生长,并阻断了DNA双链断裂损伤的修复,因而增加了头颈癌细胞的化疗敏感性。

向日葵全基因组NBS抗病基因密码子使用偏好性分析

为分析了解向日葵(Helianthus annuus L.)核苷酸结合位点(nucleotide binding site,简称NBS)型抗病基因编码时各密码子的使用情况,以向日葵全基因组NBS型抗病基因的255条基因序列为来源,利用CodonW软件对每个基因序列进行密码子统计分析。结果表明,向日葵NBS型抗病基因使用A/T(U)结尾的密码子占比大于G/C结尾的密码子,且有效密码子数(effective number of codon,简称ENC)平均值为51.40,整体偏好性较弱,但第3位碱基偏好使用以A/T(U)结尾的密码子。从同义密码子相对使用频率(relative synonymous codonw usage,简称RSCU)分析得到第3位为A、T结尾的密码子占密码子总数(RSCU>1)的比例最高。ENC-GC3s分布图表明,碱基突变是影响密码子偏好性的关键因素。同时相关性分析结果还表明,ENC与A3s、T3s呈极显著负相关关系,多种不同分析都印证了向日葵NBS型抗病基因序列偏好于以A/T(U)结尾的密码子。分析向日葵NBS型抗病基因密码子偏好性,通过优化密码子来提高NBS抗病基因在向日葵中的表达,可为向日葵分子改造和抗病育种提供理论依据。

植物NBS类抗病基因的进化

NBS(Nucleotide-binding site)类抗病基因是植物中最重要的一类抗病基因,其进化模式、结构特点和功能调控一直是抗病基因研究领域的热点。这类基因具有保守的结构域,广泛存在于植物基因组中,在不同植物基因组中数目差异较大且具有较低的表达量。此外,同源NBS类抗病基因之间通过频繁的序列交换产生广泛的序列多样性,且抗病基因位点具有较差的线性。依据基因之间序列交换的频率,抗病基因可分为TypeⅠ和TypeⅡ两类。文章从抗病基因的结构、数量、分布、序列多样性、进化模式以及表达调控等方面进行了综述,旨在为后续NBS类抗病基因的相关研究提供参考。

靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株Hela后的生物活性。方法:根据NBS1mRNA序列设计合成4对pre-microRNA片段,定向克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体上,并将其转染至Hela细胞株中。采用菌落PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时荧光定量PCR和Westernblot检测鉴定重组体对NBS1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果:构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确。重组体能干扰Hela细胞NBS1基因的表达,4组重组体NBS1基因mRNA的表达水平和蛋白表达水平均降低,其中NBS1mi-2组的表达水平最低。结论:构建的4组NBS1microRNA重组体在Hela细胞株中都具有生物活性,且NBS1mi-2组的干扰作用最强。载体构建成功,为应用microRNA靶向NBS1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。

DNA双链修复相关基因NBS1的分子改变与肿瘤发生

NBS1基因是一种重要的DNA双链修复相关基因,对维持基因组稳定性及防止细胞癌变具有非常关键的作用。近年研究发现NBS1基因的突变、SNP基因型以及NBS1蛋白表达改变与肿瘤的发生风险和预后有关,本文对此作一综述。