黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2的克隆及VIGS验证

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源。为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN 2(GenBank ID:MK618462),测序全长为4303 bp,完整的编码框长度为4092 bp,编码1363个氨基酸残基,该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因,含有1个NB-ARC和2个LRR结构域,属于具有信号肽的可溶性蛋白。核苷酸相似性分析显示,CfRFN 2与其他瓜类NBS类基因相似性在87%~98%之间;系统进化树分析表明,CfRFN2蛋白和瓜类的其他NBS类抗病蛋白聚为一个分支,其中CfRFN2蛋白与中国南瓜和美洲南瓜的RPS2、印度南瓜的RPS2-like亲缘关系最近,其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220,与甜瓜的Atg27190亲缘关系相对较远;组织表达特性分析表明,CfRFN 2基因在黑籽南瓜叶片中表达量最高,其次是茎,而在果皮和根中表达量较低。该研究采用烟草脆裂病毒载体系统,构建了黑籽南瓜VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN 2,含沉默载体的农杆菌侵染黑籽南瓜幼苗后接种枯萎病菌,qRT-PCR检测表明,接种后2 d和4 d的转pTRV2-CfRFN 2沉默组植株的CfRFN 2基因表达量比接种后同时期的野生型植株显著降低(分别下降34.75%和98.27%),病情指数增加为野生型的1.32倍,初步证明黑籽南瓜CfRFN 2基因具有抗枯萎病的功能,推测该基因可能在黑籽南瓜抗枯萎病防御过程中发挥着重要作用。该研究中NBS类基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础,也为发掘黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供新信息。

小麦全基因组NBS类R基因分析及2AL染色体NBS-SSR特异标记开发

NBS（nucleotide binding site）类基因是植物界中最重要的一类抗病基因。用信息学方法从普通小麦（Triticum aestivum L.）全基因组中分离出2406条含有NBS结构的完整蛋白序列,每条包含48~2272个氨基酸残基。根据NBS结构域两端是否连接CC或LRR结构域,将TaNBS分为N、CN、NL和CNL 4类。对TaNBS所在scaffold序列的SSR位点进行诊断,从1203条scaffold序列上发现2177个SSR位点,以二碱基重复位点最多,占73.5%。针对小麦2AL染色体上的51个SSR位点开发标记,缺体–四体和双端体验证结果表明,有39个标记（76.5%）为2AL特异标记,其中24个特异标记在抗白粉病材料Khapli（2AL上携带Pm4a）和感病材料Chancellor间存在多态性。利用近等基因系Khapli/8＊Cc筛选出3个可能与Pm4a连锁的NBS-SSR标记,分别是Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39和Sxaas_2AL46。本研究开发的与抗病序列紧密连锁的特异SSR标记可用于2AL染色体上抗病新基因的检测以及已有抗病基因的候选序列筛选。

樟树NBS-LRR类抗病基因家族分析与CcRNL基因克隆

樟树(Cinnamomum camphora L.Presl.)是自然界中较少受病原体侵害的优良抗性种质资源。利用生物信息的方法对樟树叶组织转录组数据中NBS类抗病基因进行了鉴定,对其编码的假定蛋白的理化性质、保守基序及系统发生关系等进行分析。结果表明,在樟树叶组织转录组中共找到28个具有完整编码框的NBS类抗病基因,大小在2 118-3 378 bp之间,编码蛋白等电点在5.35-9.03之间;在NBS区域内鉴定获得8个保守motifs,系统发育树将28个成员分为5个亚组。通过PCR法克隆获得2个RNL类抗病基因全长,分别命名为CcRNL1和CcRNL2,在氨基酸序列水平二者相似性为71%,在多肽N端都具有RPW8-like保守序列,暗示它们可能具有拟南芥RPW8基因所具有的广谱抗白粉病功能。采集感白粉病和正常樟树幼叶进行表达分析,结果显示CcRNL1可被樟树白粉病菌诱导表达,推测其可能参与了响应白粉病菌胁迫反应过程。

亚麻NBS类抗病基因家族全基因组分析

亚麻基因组测序完成为全基因组水平分析抗病基因提供了前提条件，而NBS类抗病基因是植物中最大的抗病基因家族之一。本研究利用生物信息学方法对亚麻全基因组中NBS类抗病基因进行了鉴定，对NBS类抗病蛋白的理化性质、基因结构、保守基序及其系统发生荚系进行了分析。结果表明：在亚麻全基因组中共找到137个NBS类抗病基因，其中分子量大于100kDa序列比例在50％以上，等电点值在5～8的范围内比例为70．07％。系统进化树将NBS类基因分成7个亚组，且同一亚组内基因的结构和保守基序保持着较高的一致性。本研究的结果将为亚麻NBS类抗病基因家族的基因定位以及相关抗病基因克隆等深入研究提供参考。

花生种皮中一种NBS类抗病基因的克隆与序列分析

利用植物抗病基因核苷酸结合位点(NBS)的保守区设计一对特异引物,以抗、感黄曲霉病花生品种J11和金花1012的种皮基因组DNA和RNA为材料进行DNA-PCR和RT-PCR扩增,经克隆、测序,得到一条504 bp的目的片段pnbs1,在GenBank上的登录号为GQ199610。Blast和Blastx分析发现pnbs1核苷酸序列与C8V1G10F抗性蛋白的核苷酸序列的同源性为89%,与抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性为59%。该片段的氨基酸序列中含有抗病基因NBS区域的3个保守模体:GPGGVGKTT、KKFFIVLDDVW和STILLTTR,推测pnbs1可能是花生NBS类抗性基因的核心区域。

植物NBS类抗病基因的进化

NBS(Nucleotide-binding site)类抗病基因是植物中最重要的一类抗病基因,其进化模式、结构特点和功能调控一直是抗病基因研究领域的热点。这类基因具有保守的结构域,广泛存在于植物基因组中,在不同植物基因组中数目差异较大且具有较低的表达量。此外,同源NBS类抗病基因之间通过频繁的序列交换产生广泛的序列多样性,且抗病基因位点具有较差的线性。依据基因之间序列交换的频率,抗病基因可分为TypeⅠ和TypeⅡ两类。文章从抗病基因的结构、数量、分布、序列多样性、进化模式以及表达调控等方面进行了综述,旨在为后续NBS类抗病基因的相关研究提供参考。

乌拉尔图小麦全基因组NBS-SSR位点分析及标记开发

[目的]本研究旨在诊断乌拉尔图小麦NBS家族所在基因组序列的SSR位点,并为抗源的发掘和利用开发分子标记。[方法]利用NBS隐马模型文件检索数据库获得目标序列,通过软件诊断序列SSR位点并开发标记,利用乌拉尔图小麦抗白粉病材料UR207和感病材料UR203进行标记验证。[结果]本研究从乌拉尔图小麦全基因组中分离出463个NBS基因,分为N、CN、NL和CNL共4类。从NBS所在scaffold序列上发现4 292个SSR位点,以二碱基重复位点最多,占78.1%。随机开发了42个分布于各染色体臂的TuNBS-SSR标记,有12个标记在UR207和UR203间存在多态性。[结论]本研究从乌拉尔图小麦全基因组中诊断出4 292个NBS-SSR位点,开发的12个标记在抗感材料间有多态性,可用于乌拉尔图小麦材料抗病性鉴定和抗病基因筛选。

黑籽南瓜NBS类抗病基因的鉴别及关键基因分析

以云南栽培的枯萎病抗病品种绿皮黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)为材料,采用二代转录组和全长转录组测序相结合的方法,对黑籽南瓜NBS类抗病基因进行鉴别和筛选。结果显示:以NB-ARC作为参考氨基酸序列,共鉴定了43条CfNBS(NBS-type gene from C.ficifolia)类基因全长序列,分属于TNL、CNL、TN、RPW8-N和N类5个亚基因家族,典型的TNL和CNL类分别有2个和13个。系统进化树分析表明,CfNBS类基因可以分为4大类群,黑籽南瓜的NBS类抗病基因数量较少但其基因进化类型比其他瓜类物种丰富。与二代转录组进行比对,筛选获得11个差异表达的黑籽南瓜NBS类关键基因,包括4个抗病蛋白、2个蛋白激酶、2个TMV抗性蛋白和3个未知功能蛋白,qRT-PCR分析表明有10个Cf NBS类关键基因在枯萎病菌接种后48和96 h出现上调或下调表达,可能参与了黑籽南瓜对枯萎病菌侵染不同时间点的抗病应答过程。11个CfNBS类关键基因的GO(Gene Ontology)功能富集分析表明,其涉及的生物学过程显著富集在防卫反应、谷胱甘肽转运、改良氨基酸转运等10条GO条目中,涉及分子功能富集在ADP结合、受体丝氨酸/苏氨酸激酶结合、细胞壁结构成分3个GO条目中。而富集通路最多的是与TMV抗性蛋白同源的2个基因(CL19588contig1和CL21402contig1),说明这2个基因在抗病应答过程中起到了重要作用。11个CfNBS类关键基因qRT-PCR组织表达特异性分析表明,在根、茎、叶和果实中表达量最高的基因分别是CL34065Contig1、CL52011Contig1、CL6035Contig1和CL19588Contig1。以上结果可为开展黑籽南瓜NBS类抗病基因的克隆和功能验证,以及解析黑籽南瓜响应枯萎病菌胁迫的抗性应答机制提供参考。

枯萎病菌胁迫下3种黑籽南瓜HQRGA2表达及抗氧化酶活性差异分析

以云南栽培的3个黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)品种(白皮、花皮和绿皮品种)为试材,在室内接种评价枯萎病抗性基础上,研究了3种材料受枯萎病菌胁迫后NBS抗病基因同源序列HQRGA2(GenBank登录号MG946756)的表达差异,以及活性氧产生和抗氧化酶活性差异。结果显示,3种黑籽南瓜HQRGA2的表达均受枯萎病菌诱导,与感病白皮品种和中抗花皮品种相比,抗病绿皮品种HQRGA2的表达水平增加迅速且持续能力强,呈增加-降低的表达特点。接种枯萎病菌后,感病品种和中抗品种■产生速率呈上升趋势,抗病品种则在侵染中后期急剧升高。感病品种和中抗品种的POD活性、MDA含量主要呈升-降-升的变化趋势,SOD活性则主要呈先升后降的变化趋势;而抗病品种的POD和SOD活性变化平稳,MDA含量呈逐步增加的趋势。枯萎病抗性与侵染早期POD和SOD活性呈负相关,与后期MDA含量呈正相关,而CAT活性与抗性并无一致性,感病品种和抗病品种的变化平稳,中抗品种表现为平稳-升高。由此表明,枯萎病菌侵染黑籽南瓜后,产生了较高水平的■,感病品种主要依赖SOD和POD,中抗品种依赖POD、SOD和CAT来清除活性氧,以增加植株的抗氧化能力。与感病品种相比,抗病品种能迅速启动并维持NBS类抗病基因序列的高量表达,其抗氧化酶可维持较高的活性水平,但对枯萎病菌胁迫不敏感。