胰岛素样生长因子Ⅰ受体反义寡核苷酸对肺癌NCI-H460细胞中该受体蛋白表达的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)反义寡核苷酸(ASODN)对肺癌NCI-H460细胞中IGF-ⅠR蛋白表达的影响。方法:设计并合成3条IGF-ⅠR反义寡核苷酸序列,转染NCI-H460细胞,另设无关的IGF-ⅠR反义寡核苷酸序列和空白培养液作对照,细胞培养48h后,蛋白酶消化收集细胞,滴于预处理的载玻片上。采用免疫细胞化学SP法检测各组NCI-H460细胞中IGF-ⅠR的蛋白表达。结果:3条IGF-ⅠR ASODN转染的NCI-H460细胞中IGF-ⅠR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),但均低于无关寡核苷酸转染组及空白培养液对照组(P<0.05)。结论:IGF-ⅠR ASODN可抑制肺癌NCI-H460细胞中IGF-ⅠR蛋白的表达。

花青素对NCI-H460细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用

目的研究花青素对大细胞型肺癌NCI-H460细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法体外培养NCI-H460细胞与25—200μg/ml的花青素共孵育，采用噻唑兰（MTT）法检测细胞增殖抑制率，Hoechst33258荧光染色观察细胞形态，DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况，流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞周期的分布。结果花青素在25—200μg／ml浓度范围内抑制NCI-H460细胞的增殖，有剂量和时间依赖性，花青素对NCI-H460细胞的IC50值为90．8μg／ml，50—200μg／ml的花青素处理NCI-H460细胞72h，Hoechest33258荧光染色可观察到核浓缩及核碎裂等细胞凋亡特征；DNA琼脂糖凝胶电泳有典型的梯形条带；流式细胞图上可看到“亚G1期”凋亡峰，25、50、100、200μg/ml花青素对NCI-H460细胞凋亡率为1．3％、2．0％、11．7％和27．8％，G0／G1细胞数目显著增多，S期细胞显著减少。结论花青素能抑制NCI-H460细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，呈剂量依赖性，并使细胞阻滞于G0／G1期。

siRNA对肺癌细胞株NCI-H460 bcl-2基因表达的影响

目的:研究siRNA (smallinterferenceRNA)对大细胞肺癌细胞株NCI -H4 6 0bcl- 2基因表达的影响。方法:利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl - 2基因为靶标的siRNA ,通过脂质体将合成的siRNA转入NCI-H4 6 0细胞株,设置转染bcl- 2反义药物G3139和空白两对照组。用MTT法检测siRNA对细胞生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期的改变和Bcl- 2蛋白表达;RT -PCR检测bcl- 2mRNA水平。结果:siRNA组与对照组细胞存活率均有显著性差异(P <0 0 5 ) ;siRNA组bcl- 2的mRNA明显低于对照组和反义组(P <0 0 5 ) ;siRNA组Bcl- 2蛋白阳性率明显低于对照组和反义组,siRNA组以及反义组细胞阻滞于S期。结论:体外转录合成的siRNA可抑制NCI-H4 6 0细胞bcl- 2基因的表达,抑制率可达5 0 %以上。

5F对非小细胞肺癌NCI-H460细胞survivin、p65和bcl-2 mRNA的影响

目的:研究5F对非小细肺癌NCI-H460细胞survivin、p65和bcl-2 mRNA水平的影响。方法:MTT法检测5F对NCI-H460细胞的生长抑制作用;用半定量RT-PCR方法检测survivin、p65及bcl-2 mRNA水平的变化。结果:5F抑制NCI-H460细胞的生长,其效果与5F的浓度和作用时间相关,24、48、72h的IC50分别为:21.40、4.52、1.02μg·mL-1;100μg.mL-15F作用NCI-H460细胞6h后能引起survivin mRNA水平显著的降低(p<0.05),24h后出现增加(p<0.05);、p65和bcl-2 mRNA水平在作用3h就发生明显减少(p<0.05)。结论:5F诱导NCI-H460细胞凋亡的机制可能是通过抑制survivin、p65和bcl-2mRNA水平来发挥作用的。

可替宁对穿孔素/粒酶B诱导的NCI-H460肺癌细胞凋亡的抑制作用

目的探讨可替宁对穿孔素/粒酶B(perforin/granzyme B)诱导的NCI-H460非小细胞肺癌细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法以人肺癌细胞株NCI-H460为研究对象,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色检测细胞生长增殖活性,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化,异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)染色后流式细胞仪定量检测细胞凋亡率,RT-PCR及Western blot法检测凋亡抑制蛋白XIAP及Survivin的表达量。结果 (1)不同浓度可替宁单独作用NCI-H460细胞时未见明显诱导凋亡现象,可显著抑制细胞生长,其抑制率与作用时间和剂量呈正相关。(2)0.25μg/ml浓度穿孔素作用NCI-H460细胞(1×106个)时,PI染核率可达到90%以上。而当加入1.5μl粒酶B(1μg/ml)孵育6h时,穿孔素/粒酶B组细胞可呈现90%以上的凋亡现象。(3)166ng/ml浓度可替宁作用穿孔素/粒酶B预处理的细胞6h时可见明显凋亡抑制现象,当检测其凋亡抑制蛋白XIAP、survivin表达量时,发现穿孔素/粒酶B组表达量明显降低,可替宁组表达量较高,而当可替宁联合穿孔素/粒酶B时表达量最高。结论可替宁可明显抑制穿孔素/粒酶B诱导的NCI-H460肺癌细胞凋亡现象,这种作用可能与凋亡抑制蛋白XIAP、survivin的表达上调有关。

木犀草素通过上调microRNA-34a-5p诱导肺癌细胞株H460凋亡的研究

探究木犀草素诱导人肺癌细胞株H460凋亡的分子机制,为其治疗肺癌提供新的科学依据。选取处于对数生长期的H460细胞株,并分为对照组和不同剂量的木犀草素组。采用CCK-8法检测木犀草素对H460细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;PCR array检测肺癌相关基因mRNA表达;Western-blot检测p53、p21、Bax、Bcl-2表达量变化;qRT-PCR法检测microRNA-34a(miR-34a)的表达水平;本实验还检测了过表达miR-34a-5p后对H460细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。结果显示,木犀草素能有效抑制人肺癌H460细胞的增殖,并促进其凋亡,其机制可能是通过激活p53信号通路,上调miR-34a-5p,最终影响凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的表达来实现的。

和厚朴酚通过NF-κB信号通路抑制IL-1诱导的人肺癌细胞H460血管生成

目的探讨和厚朴酚(honokiol,HNK)对肿瘤炎性微环境诱导的肺癌细胞H460血管生成的影响及其可能的机制。方法采用CCK-8检测HNK对H460细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响;RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达;Western blot检测信号通路蛋白p-IκBα、p-IKKα和NF-κB p65蛋白表达。采用划痕试验、Transwell迁移试验和成管试验检测HNK抑制HUVEC细胞的迁移和血管生成能力。结果HNK作用H460细胞24、48、72 h后,浓度和时间依赖地抑制H460细胞增殖。HNK能够浓度依赖的抑制HUVEC细胞的存活。HNK还降低了H460细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白质和mRNA表达水平。随后,HNK浓度依赖性地抑制了NF-κB信号通路中IκBα、NF-κB和p-IKKα。划痕试验、Transwell小室迁移试验和成管试验显示HNK处理的H460条件培养基具有抑制HUVEC细胞的迁移和血管生成能力。结论HNK可以通过抑制NF-κB途径导致VEGF的下调而降低人肺癌细胞的活力和血管生成。

重楼皂苷Ⅶ抑制肺癌H460细胞增殖和迁移能力研究

为研究重楼皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ)抑制人肺癌H460细胞增殖、迁移能力和诱导凋亡的作用和机制。本实验采用MTT法检测重楼皂苷Ⅶ处理后H460细胞生长抑制率,Hoechst 33258染色观察细胞形态,细胞集落形成实验考察细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell小室实验研究H460细胞迁移和侵袭能力的改变,并通过western blot法检测在重楼皂苷Ⅶ处理前后细胞蛋白表达变化情况。结果发现,重楼皂苷Ⅶ可显著抑制H460细胞增殖,影响其集落形成,并使细胞形态发生变化,抑制细胞体外的迁移和侵袭能力,并可诱导凋亡的发生。重楼皂苷Ⅶ处理后,H460细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9显著降低,凋亡相关蛋白剪切型caspase-3、Bax表达增加,ICAD、Bcl-2表达降低,提示重楼皂苷Ⅶ体外可能通过调节基质金属蛋白酶抑制H460细胞迁移和侵袭,同时诱导凋亡的发生。

H460细胞与单个核细胞三维立体混合培养中MMP-2和MMP-9的表达

目的:研究单个核细胞和肺癌细胞三维立体混合培养对MMP表达的影响.方法:活性胶原立体培养分为H460细胞组(HG)、单个核细胞组(MG)、混合组(HMG)3组,观察癌细胞的生长状况,用明胶酶谱法测定不同时间点各组MMP-2和MMP-9表达.结果:各组细胞在立体胶原内生长良好;MG未明显分泌MMP-2和MMP-9,HG和HMG分泌MMP-2和MMP-9,且HGM分泌的明显多于HG.结论:单个核细胞和癌细胞混合培养后MMP分泌增多.

黄芩苷对肺癌H460细胞生物学特性及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨中药单体黄芩苷对人肺癌H460细胞增殖、凋亡、上皮间质转化(EMT)、侵袭和迁移生物学特性及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测不同浓度的黄芩苷对H460细胞细胞增殖的影响,并计算半数抑制浓度(IC50)。通过流式细胞术检测黄芩苷对H460细胞凋亡的影响,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中上皮性钙黏附素(E-cadherin)、神经性钙黏附素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)基因表达量,划痕实验检测黄芩苷对H460细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测黄芩苷对H460细胞侵袭能力的影响,Western印迹检测H460细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及Wnt/β-catenin信号通路Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)等关键蛋白表达情况。结果黄芩苷可抑制H460细胞增殖,且呈浓度依赖性关系,对H460细胞的IC50为(188.1±11.52)μmol/L;黄芩苷以浓度依赖性促进H460细胞凋亡,抑制H460细胞侵袭和迁移;qRT-PCR结果发现黄芩苷能够促进H460细胞中E-cadherin基因表达,抑制N-cadherin和Vimentin基因表达;黄芩苷可下调PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达,上调Bax蛋白表达,且能够抑制Wnt/β-catenin信号通路中Wnt1和β-catenin蛋白表达。结论黄芩苷可抑制人肺癌H460细胞增殖、EMT、侵袭和迁移,促进细胞凋亡,该过程的分子机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

抗clusterin反义核酸治疗提高肺癌H460细胞放射敏感性的实验研究

目的:研究抑制clusterin的表达对肺癌H460细胞放射敏感性的影响。方法:用脂质体转染的方法将抗clusterin反义核酸转染肺癌H460细胞,以137Cs作为放射源对肺癌细胞进行放射干预。用流式细胞仪检测抗clusterin反义核酸治疗和放射干预对肺癌细胞凋亡的影响,用MTT法和克隆形成分析方法检测抗clusterin反义核酸治疗和放射干预对肺癌细胞增殖的影响。结果:抗clusterin反义核酸特异性抑制了分泌型clusterin的表达,而对核型clusterin的表达无明显作用。单纯放射干预或单纯反义核酸转染将凋亡细胞数提高了10%,反义核酸治疗联合放射干预使肺癌H460细胞的凋亡细胞数增加了25%,和单纯放疗或单纯反义核酸转染组比较有显著性差异(P<0.01)。MTT和体外克隆计数分析显示抗clusterin反义核酸治疗联合放疗干预显著抑制了肺癌H460细胞的增殖(P<0.01)。结论:体外实验提示抗clusterin反义核酸治疗可以提高肺癌细胞对放射的敏感性。

低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCI-H446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡的影响

目的探讨低剂量辐射对荷人小细胞肺癌(NCIH446)裸小鼠移植瘤细胞凋亡的影响。方法对荷人小细胞肺癌裸小鼠进行全身深部X射线照射,采用TUNEL(末端脱氧核甘酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)检测荷人小细胞肺癌裸小鼠移植瘤组织细胞凋亡的情况。结果D1组(75mGy)照射后,细胞凋亡指数(AI)呈增加趋势,但与假照组(0mGy)比差异不显著(P>0.05)。D2组(4Gy)、D1+D2组细胞凋亡指数均明显增加,与假照组(0mGy)比差异显著(P<0.010。而D1+D2组与D2组比较,D1+D2组细胞凋亡指数增加更为明显,有统计学差异(P<0.05)。结论75mGy照射对小细胞肺癌可能有一定的促细胞凋亡作用;大剂量照射及低剂量联合大剂量照射对小细胞肺癌均有促细胞凋亡作用,低剂量辐射与大剂量辐射有协同促小细胞肺癌细胞凋亡的作用。

噬菌体肽库与NCI-H1299细胞筛选肺癌特异性结合多肽ZS-9的初步研究

目的:利用噬菌体肽库与肺癌NCI-H1299细胞筛选出肺癌特异性结合的多肽,研究其亲和力和特异性。方法:以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,与噬菌体随机十二肽库进行三轮筛选,挑取单克隆扩增并测序,进行生物信息学分析、比对;利用ELISA、细胞免疫化学、组织免疫化学方法测定多肽的亲和力和特异性。结果:经过三轮减性筛选发现,随机挑选的9个单克隆中,其中1个对NCI-H1299和A549均具有较高亲和力,将其命名为ZS-9,测序结果为CAT AAT AAG CAT CTT CCG TCT ACG CAG CCT CTT GCG,根据测序结果推导出ZS-9的氨基酸序列HNKHLPSTQPLA,生物信息学分析表明ZS-9的氨基酸序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性,表明我们筛选到一种新的肺癌相关抗原的配体。结论:利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞NCI-H1299和A549具有较高亲和力的多肽ZS-9,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1在人肺癌细胞H460内的表达

n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1来自于秀丽线虫(C.elegans)。为检测该基因在人肺癌细胞H460中的表达效果,本项研究构建了哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,以Xfet polymer介导法转染到人肺癌细胞H460中,RT-PCR检测到有效的异源基因表达,MTT法证实基因表达能有效地抑制肺癌细胞的增殖率(P<0.05),气相色谱分析基因表达前后细胞中n-6/n-3多不饱和脂肪酸比例降低(P<0.05),为将该基因用于癌症的转基因治疗奠定了基础。

白藜芦醇通过线粒体凋亡通路调节肺癌H460细胞增殖与凋亡的研究

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对肺癌H460细胞增殖与凋亡的影响并探讨其可能的机制。方法:分别用浓度为0、25、100、200μmol/L的Res作用于H460细胞48 h后,采用CCK-8法检测Res对H460细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;JC-1试剂盒检测细胞内线粒体膜电位水平;ATP试剂盒检测细胞内ATP水平;Western blot法检测细胞内Bcl-2、Bax和Cytochrome c蛋白表达情况。结果:与对照组比较,CCK-8及流式结果显示Res可抑制H460细胞的增殖,并使其凋亡率升高(P<0.01);JC-1及ATP检测结果显示Res可降低H460细胞内线粒体膜电位及ATP水平(P<0.01),且在该浓度范围内呈剂量相关性;Western blot检测发现随着Res浓度的增加,Bcl-2蛋白的表达水平下降,而Bax和Cytochrome c蛋白的表达水平升高。结论:实验浓度的Res可抑制H460细胞的增殖并诱导其凋亡,这一作用的机制可能与Res激活了线粒体凋亡通路进而诱发H460细胞凋亡有关。

“七叶灵”颗粒抑制H460细胞生长和转移作用靶点的实验研究

目的观察“七叶灵”颗粒对人肺腺癌H460细胞生长的抑制作用，以及对H460细胞中COX-2、OPN和hTERT表达的影响，探讨“七叶灵”颗粒在抑制肿瘤细胞生长、延缓肿瘤细胞的转移和浸润方面的作用靶点。方法MTT法测定“七叶灵”颗粒对人肺腺癌H460细胞生长的抑制率，根据结果得出IC50值。用RT-PCR法检测不同浓度的“七叶灵”颗粒对COX-2、OPN和hTERT表达的影响。结果①“七叶灵”颗粒对人肺腺癌H460细胞的生长有抑制作用。②IC50值随时间的增加明显降低（P〈0．05）。③RT-PCR法结果显示：“七叶灵”颗粒抑制了COX-2、OPN和hTERT表达（P〈0．05）。结论“七叶灵”颗粒具有益气养精、清热解毒、消肿散结的功效，有抑制人肺腺癌H460细胞生长的作用，并通过调节COX-2、OPN和hTERT的表达，起到抑制肿瘤细胞生长，延缓肿瘤细胞转移和浸润的作用。

联合应用衣霉素增加顺铂诱导人大细胞肺癌H460细胞凋亡

目的探讨顺铂联合衣霉素对人大细胞肺癌H460细胞生长增殖的作用。方法 H460细胞在体外培养,MTT方法检测在不同浓度顺铂单独组及联合作用24h对细胞活性的影响。用Western blot法检测H460细胞内cleaved caspase-3和cytochome C的表达水平。结果 MTT结果显示顺铂能抑制H460细胞的增殖并呈现剂量依赖性,同时顺铂可以引起H460细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cytochome C的表达水平明显的升高,差异有统计学意义(P<0.05)。联合衣霉素可以进一步增加顺铂引起的H460细胞的增殖抑制作用,同时进一步增加凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cytochome C的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论衣霉素可以增加H460细胞对顺铂的敏感性,从而提高顺铂治疗大细胞肺癌的疗效。

甲基汞对人类小细胞肺癌NCI-H446细胞周期的影响

目的研究氯化甲基汞(MMC)对小细胞肺癌NCI-H446细胞周期的影响。方法采用流式细胞仪检测了MMC对NCI-H446细胞细胞周期的作用,并与目前最常用的化疗药顺铂(DDP)和同样具有剧毒的三氧化二砷(As2O3)做比较。结果MMC、DDP能使NCI-H446细胞表现为G0/G1期细胞数剂量依赖性明显增加,S期细胞数呈剂量依赖性明显减少;As2O3组细胞表现为明显的G2/M期剂量依赖性增加,S期细胞数剂量依赖性减少。结论MMC、As2O3、DDP均能诱导小细胞肺癌细胞株的细胞周期阻滞,但阻滞作用发生在细胞周期的不同时相。

地塞米松对TNF-α诱导的H460细胞增殖的影响

目的:观察地塞米松对TNF-α诱导的肺癌H460细胞增殖的影响。方法:体外培养H460细胞,经TNF-α刺激后,随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同浓度地塞米松的DMEM培养液。通过MTT比色实验观察各组的值。结果:TNF-α(12.5～100 ng/ml)可促进H460增殖(P<0.01),而地塞米松(25～200μg/ml)可以抑制这种作用(P<0.01)。结论:对于TNF-α诱导肺癌H460细胞增殖而言地塞米松是一种良好的抑制剂。

IRS1在藻蓝蛋白介导的H460细胞增殖和迁移调控中的作用

藻蓝蛋白来源于海洋藻类,是我国认可的食品着色剂和功能型食品.初期研究表明,藻蓝蛋白处理能抑制人类非小细胞肺癌系H460的体外增殖能力和迁移能力,使得其体外集落形成能力减弱.通过转录组学测序分析进一步探究具体作用机制,从藻蓝蛋白处理前后发生显著变化的基因中,筛选出了一个藻蓝蛋白处理后发生显著下调的基因,即胰岛素受体底物1(irs1),并通过体外转染siRNA的方法抑制IRS1的表达,来研究其对非小细胞肺癌系H460的增殖和迁移能力的影响.采用MTT法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,流式细胞术检测细胞周期分布.结果表明,下调IRS1的表达后,与对照组相比,细胞的生长速率降低,迁移能力、集落形成能力受到抑制,同时使细胞周期被阻滞到G1期.PI3K-AKT信号通路研究表明,藻蓝蛋白处理使得PI3K-AKT信号通路活性受到抑制,下调IRS1的表达使得PI3K-AKT信号通路部分蛋白表达也下调,通路活性受到一定程度抑制.本研究结果表明,藻蓝蛋白抑制非小细胞肺癌系H460体外活性功能的机制,可能与IRS1的表达和PI3K-AKT信号通路的活性有关,这为藻蓝蛋白的调控机制提供了有力的理论基础.