苦杏仁苷抑制人肺癌NCI-H1299细胞体外侵袭的机制

探讨天然产物苦杏仁苷对人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞体外侵袭与转移的抑制作用及其机制。采用MTS法检测苦杏仁苷对肿瘤细胞生长的影响;采用Transwell小室和划痕试验检测苦杏仁苷对细胞侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot和RT-PCR试验检测苦杏仁苷对MMP-2/9、integrinβ1、integrinβ4、整合素连接激酶(ILK)、黏附斑激酶(FAK)、p-FAK和β-catenin的表达水平,以及Akt和RICTOR的磷酸化水平的影响。结果表明:苦杏仁苷可显著抑制H1299细胞体外增殖,0.5和1 mg/m L苦杏仁苷作用H1299细胞48 h后,肿瘤细胞侵袭、迁移能力显著下降,MMP-2/9、integrinβ1/4、ILK、FAK、β-catenin蛋白和mRNA表达,MMP-2/9活性以及FAK、Akt和RICTOR磷酸化水平显著下调(P均<0.05)。

芹菜素对人肺癌NCI-H1299细胞的生长抑制和凋亡诱导的作用

目的研究芹菜素对人肺癌NCI-H1299细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法体外常规培养NCI-H1299细胞,芹菜素作用终浓度分别为10、20、40、80μmol/L。MTT法测定芹菜素对细胞的生长抑制作用;Hoechst 33258细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Western blot方法检测芹菜素对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结果芹菜素能够抑制NCI-H1299细胞的增殖,并随药物浓度的增加、作用时间的延长,作用更明显;Hoechst 33258染色结果显示,芹菜素处理组细胞出现核固缩、染色质凝集和凋亡小体产生等典型的细胞凋亡特征;不同浓度的芹菜素作用24 h,细胞凋亡率逐渐增加,呈一定浓度依赖性;Western blot结果显示,芹菜素处理组细胞Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。结论芹菜素能够抑制人肺癌NCI-H1299细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与调控Bax和Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax比值下降有关。

非小细胞肺癌患者血清外泌体中表皮生长因子受体的表达情况及其对NCI-H1299细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清外泌体中表皮生长因子受体(EGFR)的表达情况以及对NSCLC细胞NCI-H1299增殖和侵袭的影响。方法选取10例原发NSCLC患者(NSCLC组)及8例健康者(正常组)的血清标本,提取分离血清中的外泌体并进行鉴定后,检测外泌体中EGFR蛋白的表达水平。收集15例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织,检测组织中EGFR mRNA的表达水平,并分析NSCLC患者血清外泌体EGFR蛋白表达水平与NSCLC组织EGFR mRNA表达水平的相关性。取对数生长期NCI-H1299细胞,分为NSCLC组、正常组、对照组,NSCLC组、正常组细胞分别加入NSCLC患者、正常健康人血清外泌体悬液,检测培养24 h、48 h、72 h、96 h后细胞增殖情况,以及培养48 h后细胞的侵袭能力。结果NSCLC组外泌体中EGFR蛋白的相对表达水平高于正常组,NSCLC组织中EGFR mRNA相对表达水平高于癌旁组织,两者呈正相关(均P<0.05)。NSCLC组NCI-H1299细胞培养48 h、72 h、96 h后的细胞增殖情况以及培养48 h后的侵袭能力均高于其他两组(均P<0.05)。结论NSCLC患者血清外泌体中EGFR蛋白表达上调,且与肿瘤组织中的EGFR mRNA表达呈正相关;NSCLC患者血清外泌体可促进NCI-H1299细胞增殖和侵袭能力。

人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

背景与目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌组织学类型,也是病死率最高的恶性肿瘤之一。多肽作为光学分子成像探针的主体可以实现肿瘤的早期筛查及诊断,提高患者存活率。本研究旨在利用体内噬菌体展示技术筛选与人NSCLC细胞NCI-H1299高度结合的小分子多肽并通过体外实验鉴定其结合特异性。方法制备NCI-H1299细胞荷瘤裸鼠模型,用噬菌体展示环七肽库进行3轮体内筛选后随机挑取噬菌体克隆,免疫组织化学法及酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定噬菌体克隆对NCI-H1299细胞的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体DNA测序获得外源多肽氨基酸序列,将重复率最高的序列化学合成多肽并进行异硫氰酸荧光素(fluorescein,FITC)标记,制备光学分子探针,初步鉴定其对NCI-H1299细胞的特异性。结果经3轮体内筛选后噬菌体富集率是首轮的341.3倍;免疫组织化学染色显示随着筛选次数增加,肿瘤组织中结合的噬菌体不断增加,且结合量明显高于正常组织;ELISA结果显示随机挑取的30个噬菌体克隆中20个为阳性克隆,经测序后将重复率最高的序列合成多肽并命名为NSP1;四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium assay,MTT)、细胞划痕实验表明NSP1不会影响细胞增殖、迁移;流式细胞术、细胞免疫荧光结果表明NSP1可与NCI-H1299细胞特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术成功得到了与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽NSP1,为NSCLC的早期诊断及靶向治疗奠定了研究基础。

噬菌体随机肽库淘选肺癌细胞NCI-H1299特异性结合多肽

目的利用噬菌体展示肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的20个单克隆中,其中6号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZS6。细胞免疫荧光试验进一步证明,合成的相应多肽FITCZS6对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZS6,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

噬菌体肽库与NCI-H1299细胞筛选肺癌特异性结合多肽ZS-9的初步研究

目的:利用噬菌体肽库与肺癌NCI-H1299细胞筛选出肺癌特异性结合的多肽,研究其亲和力和特异性。方法:以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,与噬菌体随机十二肽库进行三轮筛选,挑取单克隆扩增并测序,进行生物信息学分析、比对;利用ELISA、细胞免疫化学、组织免疫化学方法测定多肽的亲和力和特异性。结果:经过三轮减性筛选发现,随机挑选的9个单克隆中,其中1个对NCI-H1299和A549均具有较高亲和力,将其命名为ZS-9,测序结果为CAT AAT AAG CAT CTT CCG TCT ACG CAG CCT CTT GCG,根据测序结果推导出ZS-9的氨基酸序列HNKHLPSTQPLA,生物信息学分析表明ZS-9的氨基酸序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性,表明我们筛选到一种新的肺癌相关抗原的配体。结论:利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞NCI-H1299和A549具有较高亲和力的多肽ZS-9,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。

人参炔三醇通过下调ERK1/2和mTORC1通路调控肺癌NCI-H1299细胞的增殖、凋亡

目的研究人参炔三醇(PXT)对肺癌NCI-H1299细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其潜在作用机制。方法MTT检测PXT对NCI-H1299细胞增殖的影响;流式细胞术检测PXT对NCI-H1299细胞凋亡的影响;Western blotting检测PXT作用前后ERK1/2和mTORC1通路相关因子及凋亡相关因子Bcl-2的表达。结果PXT可有效抑制肺癌NCI-H1299细胞的增殖,且抑制效果与作用浓度和时间呈正相关(P<0.05)。PXT作用于NCI-H1299细胞后,凋亡细胞数明显增加(P<0.05)。PXT可降低p-ERK1/2、p-mTORC1及下游调控因子p65的磷酸化水平,并降低抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平(P<0.05)。结论PXT可通过下调ERK1/2和mTORC1通路来抑制肺癌NCI-H1299细胞的增殖,并诱导其凋亡。

透明质酸修饰山柰酚纳米结构脂质载体的制备及对非小细胞肺癌细胞NCI-H1299的抑制作用

目的:制备以相对分子质量为200000与1300000的透明质酸(hyaluronic acid,HA)修饰的山柰酚纳米结构脂质载体,并考察其对NCI-H1299细胞的抑制作用。方法:建立山柰酚含量的测定方法并进行方法学考察,采用熔融超声法制备山柰酚纳米结构脂质载体(KA-NLC),在此基础上以静电吸附法制备透明质酸修饰的山柰酚纳米结构脂质载体(HA-KA-NLC),通过EdU染色法、克隆形成试验、Hoechst染色法、细胞划痕试验、Transwell法分别考察所得制剂对NCI-H1299细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的抑制作用。采用激光共聚焦显微镜观察NCI-H1299细胞在1,2,4 h对不同制剂的摄取情况,同时采用Westen blot法考察所得制剂对上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的关键性蛋白表达的影响,初步探讨其对NCI-H1299的干预机制。结果:相对于KA-NLC,经过HA修饰后的HA-KA-NLC在抑制肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用更为突出,且有更为良好的摄取效果和EMT干预作用,而以200000相对分子质量修饰后的KA-NLC相对于1300000相对分子质量修饰所得制剂在全面抑制NCI-H1299方面有着更为突出的表现。结论:HA_(20)-KA-NLC对NCI-H1299有较强的抗肿瘤作用,可以用于开发优良的靶向制剂,在未来治疗NSCLC中具有一定的应用前景。

携带凋亡素基因的重组腺病毒对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299凋亡的影响

目的:研究携带凋亡素基因VP3的重组腺病毒载体Adxsi-GFP-VP3对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299的凋亡的影响。方法:取对数生长期SK-MES-1、NCI-H1299细胞,各分为重组腺病毒(Adxsi-GFP-VP3)组、空病毒(Adxsi-GFP)组和细胞对照(磷酸盐缓冲液)组,依次记为A、B、C组。采用逆转录-聚合酶链反应和Western blot法检测A、B组细胞转染48、72 h的VP3 mRNA和Apoptin表达情况,透射电镜观察A组细胞转染72 h的超微结构变化。采用MTT法检测3组细胞转染24、48、72、96 h的细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞转染后24、48、72 h的凋亡率及细胞周期变化。结果:与B组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞转染48 h后有VP3 mRNA表达,转染72 h后有Apoptin表达。A组转染72 h后SK-MES-1、NCI-H1299细胞均出现细胞凋亡的超微结构改变。与B、C组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞增殖活性降低、细胞凋亡率增加,且与转染时间呈正相关;转染72 h S期的SK-MES-1、NCI-H1299细胞比例降低、G2/M期细胞比例增加。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:Adxsi-GFP-VP3能有效诱导SK-MES-1、NCI-H1299细胞凋亡。

香芹酚诱导非小细胞肺癌1299细胞凋亡的实验研究

目的探讨香芹酚(CV)对人非小细胞肺癌(NSCLC)NCI-H1299细胞的增殖、凋亡及侵袭的作用及可能机制。方法以不同浓度的CV(20、40、60、80μmol/L)处理NCI-H1299细胞,以未经CV处理的细胞为对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Transwell法检测40μmol/L CV处理组和对照组细胞侵袭能力;实时荧光定量PCR及Western blot检测40μmol/L CV处理组和对照组的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9、基质金属蛋白酶(MMP)-9、TIMP-1的m RNA及蛋白水平的表达变化。结果与对照组比较,CV各处理组NCI-H1299细胞存活率均明显降低,而凋亡率增加(P<0.05),但抑制效应均不呈浓度依赖性(P>0.05)。CV处理组侵袭细胞数(40.67±3.63)个明显低于对照组(76.00±5.78)个(P<0.01)。CV处理组较对照组caspase-9、TIMP-1的m RNA和蛋白表达水平均增高,MMP-9的m RNA和蛋白表达水平均降低(P<0.01)。结论CV可诱导人NSCLC NCI-H1299细胞凋亡,抑制其侵袭,作用机制可能与caspase-9的活性增加及MMP-9的下调有关。

lncRNA ZFAS1在肺癌中的表达及其对肺癌细胞生物学功能的影响及机制研究

目的:探究lncRNA ZFAS1在肺癌中的表达及其对肺癌细胞生物学功能的影响,同时通过构建肺癌裸鼠移植瘤模型,探寻其可能存在的分子机制。方法:采用qRT-PCR检测ZFAS1在肺癌组织和细胞系中的mRNA表达水平及荧光原位杂交(FISH)技术检测肺癌组织中ZFAS1的阳性指标;受试者工作特征(ROC)曲线检测血清中ZFAS1在肺癌临床诊断中的灵敏度和特异度;Transwell侵袭实验、细胞划痕实验及Tunel细胞凋亡实验检测上调/下调ZFAS1对NCI-H1299和NCI-H460细胞侵袭、迁移及凋亡的影响;检测肺癌裸鼠皮下移植瘤生长情况;Ki67和PCNA免疫荧光和PCNA免疫组化实验检测裸鼠体内细胞增殖情况。结果:ZFAS1 mRNA表达在肺癌组织和各细胞系中均上调;ROC曲线显示当ZFAS1的相对表达量取值为0.84时,其敏感度和特异度分别为86.7%和76.7%;过表达ZFAS1促进NCI-H1299细胞侵袭、迁移及抑制细胞凋亡,而干扰ZFAS1则抑制NCI-H460细胞侵袭、迁移及促进细胞凋亡;ZFAS1促进裸鼠皮下瘤体生长;ZFAS1在裸鼠皮下肺癌组织中的阳性指标显著增加;上调ZFAS1能促进裸鼠体内细胞增殖,下调ZFAS1则产生抑制作用。结论:ZFAS1可促进肺癌细胞NCI-H460和NCI-H1299侵袭、迁移及抑制细胞凋亡,并促进裸鼠皮下肿瘤生长及裸鼠体内细胞增殖,而干扰ZFAS1则能产生相反结果。因此,ZFAS1有望成为肺癌诊断及治疗的新靶点。

肺癌特异性结合多肽的体外筛选和鉴定

目的应用噬菌体随机肽库技术筛选出与肺癌细胞特异性结合的多肽。方法以人肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,人胚肺细胞MRC-5为吸附细胞,对噬菌体随机12肽库进行3轮全细胞减性筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行ELISA鉴定;对亲和力较高的阳性克隆进行DNA测序并翻译为氨基酸序列;化学合成异硫氰酸荧光素标记的多肽(FITC-ZS-5),采用细胞和组织免疫荧光法鉴定FITC-ZS-5与肺癌细胞的亲和力及特异性。结果通过3轮减性筛选后,与NCI-H1299细胞结合的噬菌体克隆得到有效的富集;ELISA结果显示5号克隆对NCI-H1299细胞亲和力最高,将其命名为Phage ZS-5;测序结果显示Phage ZS-5所表达的多肽序列在国内外均未见报道,细胞及组织免疫荧光实验结果显示FITC-ZS-5对肺癌细胞及组织具有较高的亲和力和特异性。结论应用噬菌体随机肽库技术筛选到肺癌靶向性多肽ZS-5,为肺癌的靶向治疗和诊断奠定基础。

LV-ERK1-RNAi转染人非小细胞肺癌细胞的ERK1/2、DNA甲基转移酶1表达观察

目的观察细胞外信号调节激酶1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-ERK1-RNAi)转染后人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞NCI-H1299中细胞外信号调节激酶1(ERK1)、ERK2、DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA及ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、DNMT1蛋白表达情况。方法体外培养NCI-H1299细胞,将细胞随机分为3组,KD组和NC组细胞分别转染LV-ERK1-RNAi、阴性对照病毒,CON组不作处理。转染72 h后,采用荧光显微镜观察细胞荧光率,实时荧光定量基因扩增法检测细胞中ERK1/2、DNMT1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测细胞中ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白。结果空白对照组细胞无绿色荧光蛋白表达,阴性对照病毒组、LV-ERK1-RNAi组转染效率达80%以上。与NC组、CON组比较,KD组ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达下降(P均<0. 05)。结论 LV-ERK1-RNAi转染后NCI-H1299细胞ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达降低,ERK2表达正常,表明LV-ERK1-RNAi特异敲低ERK1而调控DNMT1的表达。

细胞微丝骨架在NDV诱导肺癌细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞微丝骨架在新城疫病毒(NDV)诱导非小细胞肺癌系NCI-H1299细胞增殖和凋亡中的作用及凋亡机制的探索。方法形态学观察病毒感染后细胞表面结构及超微结构改变;CCK-8法检测NDV对人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞株的抑制作用;流式细胞术检测NDV作用于NCI-H1299细胞后的凋亡率;Western blot检测NDV F3作用NCI-H1299细胞0、24、36、48 h后,微丝骨架相关蛋白RhoA、ROCK2、F-actin、P-MYPT1蛋白表达的改变;细胞划痕试验及Transwell试验观察NDV F3感染后对细胞迁移能力的影响。结果通过普通倒置显微镜及扫描电镜观察到NDV F3作用后细胞失去正常形态,出现融合现象及死亡细胞,结构发生改变,细胞表面微绒毛变短、膨大甚至脱落;CCK-8结果显示NDV F3对NCI-H1299有抑制作用,并且具有时间和浓度依赖性(P<0.05);流式细胞术结果显示凋亡率在24 h内随NDV F3感染时间的延长而增加(P<0.01);Western blot结果显示随病毒作用时间的延长,与微丝骨架密切相关的RhoA/ROCK通路中RhoA、ROCK2、F-actin、P-MYPT1蛋白表达水平均出现下调(P<0.05)。细胞划痕试验及Transwell试验发现,NDV感染组细胞划痕愈合速度与对照组相比减慢,细胞迁移能力受到极大的抑制(P<0.01)。结论 NDV F3能够抑制NCI-H1299细胞的增殖、侵袭、迁移并能够诱导凋亡,其凋亡机制可能与微丝骨架密切相关的RhoA/ROCK信号通路有关。