LncRNANNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1轴激活Hippo-YAP/TAZ信号通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞干性影响

目的检测膀胱癌中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1,NNT-AS1)表达情况,研究其对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响及可能分子机制。方法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测膀胱癌组织标本及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况;将膀胱癌细胞转染分为sh-NC组,sh-NNT-AS1组,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组。采用CCK-8法检测细胞增殖吸光度值(A值);Transwell实验检测细胞迁移、侵袭穿膜数;细胞成球实验检测干细胞干性。检索starBase和TargetScan数据库,并通过双荧光素酶报告基因实验预测验证LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p,miR-582-5p与NCKAP1的靶向结合关系。Western blot检测膀胱癌干细胞标志蛋白(CD44,ALDH1A1,Oct4,Nanog)及Hippo-YAP/TAZ信号通路相关蛋白表达灰度值。结果与癌旁组织相比,膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平(0.34±0.07 vs 1.15±0.21)明显升高,差异有统计学意义(t=16.364,P<0.001)。与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞(1.00±0.01)相比,膀胱癌细胞T24,5637,UM-UC-3和TCC-SUP中LncRNA NNT-AS1表达(6.03±0.17,4.66±0.36,5.47±0.26,3.02±0.20)明显升高,差异有统计学意义(t=17.472~51.160,均P<0.001)。与sh-NC组相比,在24,48和72 h时sh-NNT-AS1组细胞增值能力(A值)均显著降低(0.80±0.01 vs 1.07±0.06,1.18±0..07 vs 1.83±0.03,1.89±0.07 vs 2.53±0.06),差异有统计学意义(t=7.688,14.783,12.024,均P<0.05);sh-NNT-AS1组细胞迁移穿膜数(55.00±2.65个vs 354.30±7.84个)、细胞侵袭穿膜数(45.67±2.33个vs 303.00±9.07个)及膀胱癌干细胞成球数(20.85±2.17个vs 41.35±3.67个)显著降低,差异具有统计学意义(t=-62.641,-47.596,8.328,均P<0.001)。与sh-NC组相比,sh-NNT-AS1组细胞中CD44(0.04±0.01 vs 1.12±0.02),ALDH1A1(0.23±0.01 vs 1.16±0.05),Oct4(0.17±0.02 vs 1.10±0.04),Nanog(0.49±0.03 vs 1.24±0.03)的蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=83.656,31.591,36.019,30.619,均P<0.001)。与si-NC组相比,sh-NNT-AS1组CD44+CD133+细胞比例(9.30%±0.79%vs 88.50%±2.77%)明显降低,差异有统计学意义(t=-47.624,P<0.001)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-582-5p为LncRNANNT-AS1靶基因,NCKAP1为miR-582-5p靶基因;LncRNA NNT-AS1靶向调控miR-582-5p/NCKAP1轴。与sh-NNT-AS1组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞增值能力(A值)均明显升高(0.98±0.03 vs 0.73±0.06,1.74±0.04 vs 1.22±0.05,2.33±0.16 vs 1.69±0.14),差异有统计学意义(t=5.977~11.628,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞增值能力(A值)显著降低(0.69±0.04,1.01±0.07,1.39±0.08),差异有统计学意义(t=7.877~16.323,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞迁移穿膜数(322.31±28.45个vs 81.42±13.22个)、细胞侵袭穿膜数(316.07±30.21个vs 92.13±12.65个)及膀胱癌干细胞成球数(38.55±2.20个vs 18.98±1.16个)显著增加,差异具有统计学意义(t=15.115,13.158,14.592,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞CD44(1.05±0.08 vs 0.10±0.01),ALDH1A1(1.20±0.16 vs 0.22±0.02),Oct4(1.32±0.14 vs 0.19±0.03),Nanog(0.97±0.12 vs 0.15±0.04),YAP(1.29±0.11 vs 0.42±0.07)和TAZ(1.41±0.16 vs 0.35±0.05)蛋白表达灰度值均显著增加,差异具有统计学意义(t=10.650~21.243,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞迁移穿膜数(65.33±12.60个)、细胞侵袭穿膜数(71.08±15.19个)、膀胱癌干细胞成球数(11.36±1.05个)均显著降低,差异具有统计学意义(t=16.125,14.395,21.365,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞CD44(0.25±0.05),ALDH1A1(0.61±0.11),Oct4(0.22±0.08),Nanog(0.44±0.07),YAP(0.25±0.09)和TAZ(0.30±0.04)蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=6.412~17.889,均P<0.001)。结论膀胱癌中LncRNA NNT-AS1表达上调,其对膀胱癌细胞增殖、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响,可能是通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴,激活Hippo-YAP/TAZ信号通路完成。

FOXP3通过下调NCKAP1的表达抑制乳腺癌转移

目的探讨FOXP3对乳腺癌转移的影响及分子机制。方法在乳腺癌细胞系MCF7中转染FOXP3质粒,进行高通量转录组测序以及基因差异表达分析。在T47D和MCF7中均过表达和敲低FOXP3,RT-qPCR检测NCKAP1的表达。利用Jaspar数据库分析NCKAP1基因的启动子,ChIP实验检测FOXP3与NCKAP1基因启动子的结合活性,报告基因实验检测不同FOXP3的表达水平对NCKAP1启动子转录活性的影响。单独si-FOXP3、si-FOXP3和si-NCKAP1、control siRNA分别转染T47D细胞,划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。在GEPIA数据库中分析乳腺癌病人NCKAP1的表达水平以及生存期。在TCGA和GEPIA数据库中分析乳腺癌病人FOXP3和NCKAP1基因的表达相关性。结果转录组测序结果表明,高表达FOXP3的MCF7细胞中NCKAP1表达下调。MCF7细胞和T47D细胞过表达FOXP3后,NCKAP1表达水平降低(P<0.05)。沉默FOXP3后,MCF7细胞(P<0.01)和T47D细胞(P<0.001)内NCKAP1表达水平升高。NCKAP1基因的启动子上存在FOXP3的潜在结合位点,T47D细胞内FOXP3与NCKAP1基因的启动子结合(P<0.01)。FOXP3抑制NCKAP1启动子的转录活性(P<0.001),且FOXP3表达水平越高抑制效果越明显(P<0.05)。沉默FOXP3后,T47D细胞的迁移(P<0.01)和侵袭(P<0.001)能力增强,同时沉默FOXP3和NCKAP1后,T47D细胞的迁移和侵袭能力降低(P<0.001)。NCKAP1高表达的乳腺癌患者预后较差(P<0.05)。FOXP3和NCKAP1的表达量呈负相关(r=-0.1563,P<0.001)。结论FOXP3通过与NCKAP的启动子结合下调其表达,从而抑制乳腺癌的转移。

基于基因表达谱芯片的人参对衰老脑组织作用研究

应用生物芯片技术诠释中药抗衰老作用基因机理的研究日益得到人们的重视。针对D-半乳糖造成的小鼠亚急性衰老模型,采用Cy3和Cy5 2种不同的荧光染料,通过逆转录反应将实验组和对照组的小鼠脑组织细胞mRNA分别标记成2种探针,混合后与小鼠基因表达谱芯片杂交,借助计算机分析扫描芯片荧光信号图像,寻找出经人参作用后表达有显著差异的基因,并对这些基因进行了生物信息学分析。研究表明人参水煎剂对衰老小鼠脑组织的基因表达谱具有显著影响,其中N ckap1基因及A tp5a1基因可能是人参抗衰老作用的靶基因。