核受体共激活因子NCOA5单克隆抗体的制备及其在乳腺癌中的表达研究

目的探讨核受体共激活因子NCOA5单克隆抗体在诊断人乳腺癌中的应用。方法应用小鼠杂交瘤技术制备能够识别NcoA5蛋白的单克隆抗体。利用该抗体采用免疫组化检测100例乳腺浸润性导管癌中NCOA5的表达。结果成功制备能够特异识别野生型NCOA5的单克隆抗体8B11，用于乳腺癌标本检测发现，随着肿瘤的增大，NCOA5的阳性表达率升高（P=0．008）；在有淋巴结转移组中，NCOA5的阳性表达率升高（P=0．042）；随着肿瘤TNM分期的增加，NCOA5的阳性表达率逐渐上升（P=0．028）；NCOA5在ER阴性标本中阳性表达率显著升高（P=0．006）；NCOA5在PR阴性标本中阳性表达率升高（P=0．025）；NCOA5表达与年龄、组织学分级、HER．2差异无统计学意义（P〉0．05）。结论利用杂交瘤技术成功制备一株效价高、特异性好单克隆抗体8811；NCOA5在乳腺癌中阳性表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及ER、PR的表达水平相关，可为乳腺癌的诊断及治疗提供一定依据。

抗白细胞介素-5单克隆抗体治疗哮喘效果的Meta分析

目的:系统评价抗白细胞介素-5(IL-5)单克隆抗体治疗哮喘的临床效果。方法:在PubMed、Embase和Cochrane对照试验中央注册中心检索有关抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的随机对照试验文献,检索时间为截至2024年3月,对数据采用CMA 2.0软件进行Meta分析。结果:纳入21篇文献,共8717例患者,试验组4593例,对照组4124例。Meta分析结果显示,在第1秒用力呼气容积(FEV1)、哮喘生活质量问卷评分、不良事件发生情况方面,试验组优于对照组。结论:抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的临床效果较好,可改善患者FEV1、生活质量,且安全性较高。

基于高通量表面等离子体共振技术筛选与TPBG具有高亲和力的单克隆抗体研究

目的探讨从制备的单克隆抗体中快速筛选出与滋养层糖蛋白(TPBG)具有高亲和力的单克隆抗体的方法。方法采用高通量表面等离子体共振技术(SPR),将不同种属的TPBG通过氨基偶联的方式固定在GLC传感器芯片上,梯度稀释的抗体作为流通相,筛选能高度亲和TPBG的单克隆抗体,并测定相互作用的动力学常数。抗体1结合人和食蟹猴TPBG,亲和力分别为65.0、31.6 nmol/L;抗体6结合人、小鼠、食蟹猴TPBG,亲和力分别为77.6、92.1、87.7 nmol/L。结果该研究成功筛选出2种能与TPBG特异性结合的单克隆抗体。动力学图谱显示,这2种抗体与TPBG蛋白的特异性结合稳定。结论采用SPR可筛选出与TPBG蛋白具有高亲和力的单克隆抗体,为开发出一些新型的抗肿瘤药物提供一种方法。

抑制EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤增殖的抗TMD5单克隆抗体的筛选和效果评价

目的:筛选抗爱泼斯坦—巴尔病毒(EBV)潜伏期膜蛋白-1中跨膜结构域5(TMD5)单克隆抗体并评价其抑制EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的效果。方法:人工合成TMD5肽段,用此TMD5肽段免疫BALB/c小鼠;PEG法制备杂交瘤;ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞;有限稀释法制备单克隆;使用阳性孔单克隆细胞免疫小鼠制备腹水;western blotting法和ELISA法分别对腹水中的单克隆抗体进行鉴定和效价测定;体外CCK-8法测定腹水对Sp2/0细胞存活能力的影响;Annexin VFITC/PI双标记流式细胞术测定腹水对Sp2/0细胞凋亡率的影响;在体内裸鼠荷瘤实验测定腹水对裸鼠荷瘤生长的影响。结果:成功备制13个杂交瘤,其中3个为阳性杂交瘤,分别为2B11、5D07和6F04,阳性率为23%。以5D07孔单克隆细胞制备的腹水以1∶105稀释后,阳性/阴性腹水单克隆抗体抗TMD5效价比为6.763,阳性/Sp2/0的效价比为5.952,效价最高。与PBS组相比,2B11组和5D07组DB细胞48 h和72 h增殖能力降低,凋亡率升高,裸鼠荷瘤较小(P<0.05),6F04组上述测定指标无明显差异(P>0.05)。与2B11组相比,5D07组DB细胞48 h和72 h增殖能力降低,凋亡率升高,裸鼠荷瘤较小(P<0.05)。结论:通过杂交瘤法筛选出的5D07单克隆抗体抗TMD5效价高,在体外和在体裸鼠荷瘤实验抗EBV+DLBCL淋巴瘤活性良好。

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的：研制抗DR5单克隆抗体（mAb），并鉴定其特性。方法：以纯化的DR5免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5 mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用。以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果：获得4株可分泌抗DR5 mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1；腹水mAb效价为1×10^-4-5×10^-6；亲和常数为1×10^9水平，4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论：获得4株抗DR5的mAb，为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

目的制备和鉴定禽流感病毒（H5N1）血凝素（H5）特异性单克隆抗体（mAb）,建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。方法以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制（HI）实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。结果获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1∶100-1∶51200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性。结论建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断。

抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导Jurkat细胞凋亡活性研究

目的:观察抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的死亡受体5(DR5)单克隆抗体——mDRA-6对Jur- kat细胞的凋亡作用。方法:DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗人DR5单抗——mDRA-6;光镜下观察mDRA-6作用下Jurkat细胞形态变化;MTT方法计算mDRA-6不同浓度、不同作用时间对Jurkat细胞凋亡率影响。结果:mDRA-6致Jurkat细胞染色质边集、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;MTT法显示mDRA-6具有明显的Jurkat细胞杀伤作用, 0．1μg/ml的mDRA-6即可使Jurkat细胞存活率降至77．2％;25．6μg/ml的mDRA-6作用8小时,可使Jurkat细胞存活率降至 28．4％;Annexin v及PI双染显示1 μg/ml的mDRA-6作用10小时,Jurkat细胞凋亡率达81．82％。结论:抗DR5单抗—— mDRA-6具有高效诱导Jurkat细胞凋亡的活性。

高致病性H5亚型禽流行性感冒病毒血凝素单克隆抗体的制备与初步应用

以禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)作为免疫原,利用常规杂交瘤技术和血凝抑制试验法成功地筛选出6株稳定分泌抗高致病性H5亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体(单抗),分别命名为2F2、3C8、3FC1、7C6、10HD4和13G4。经血凝抑制试验法分析,结果发现这6株单抗具有特异性高、反应性强、识别谱宽且互补等特点。基于单抗2F2,初步建立了三种H5N1病毒诊断方法,经评估证实均具有很好的特异性。由此说明,研究制备的抗H5亚型禽流感病毒血凝素单抗可适用于H5N1病毒的诊断。

抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系HepG2致凋亡的作用。常规培养人肝癌细胞系HepG2,流式细胞术定量分析检测HepG2细胞表面DR5的表达。MTT法检测mDRA-6的细胞毒性作用;Annexin V-FITC/PI双色标记HepG2细胞,流式细胞术定量分析检测细胞凋亡率;在荧光显微镜下观察mDRA-6对HepG2细胞形态变化的影响。结果显示,HepG2细胞表面有DR5表达,其平均表达百分率为40%。MTT法检测显示在40 mg/L mDRA-6浓度下可杀伤42%的细胞;Hoechst33258染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的经流式细胞术检测显示,3 mg/L的mDRA-6作用HepG2细胞6 h导致24.61%的细胞发生凋亡;在荧光显微镜下可观察到mDRA-6诱导导致HepG2细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征。上述结果表明,mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡。

抗人DR5单克隆抗体对人肝细胞系HL7702的凋亡作用

目的:探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA6)对人肝细胞系HL7702致凋亡的作用。方法:流式细胞术检测HL7702细胞表面DR5的表达。在荧光显微镜下观察mDRA6对HL7702细胞形态变化的影响;MTT法检测mDRA6的细胞毒性作用;AnnexinVFITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:mDRA6导致HL7702细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征;MTT法检测显示在40mg/L浓度下可杀伤39%的细胞;经流式细胞术检测显示,3mg/L的mDRA6作用HL7702细胞6h导致25.5%的细胞发生凋亡。结论:mDRA6能够诱导人肝细胞系HL7702凋亡,mDRA6具有诱导细胞凋亡的活性。

抗人DR5单克隆抗体的制备、鉴定及活性分析

目的制备抗人DR5单克隆抗体(mAb),鉴定其特性,并进行生物学活性分析。方法以纯化的可溶性DR5(sDR5)免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备抗人DR5mAb;运用ELISA、SDS-PAGE电泳方法测定抗DR5mAb与sDR5结合的特性;Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb亚类;间接ELISA法检测腹水mAb效价;流式细胞仪检测肿瘤细胞表面DR5的表达水平;流式细胞仪检测抗DR5单克隆抗体(mAb)诱导肿瘤细胞凋亡的功能。结果获得1株可分泌抗DR5mAb的杂交瘤细胞系R150。SDS-PAGE电泳检测证实,获得的R150可特异性地识别DR5;R150的Ig亚类为IgGI(λ型);腹水效价为1×106;通过流式细胞仪可敏感地检测到肿瘤细胞表面DR5的表达水平及R150诱导肿瘤细胞凋亡情况。结论获得1株可分泌抗DR5mAb的细胞系R150,抗体具有效价高、特异性强等特点并能有效诱导肿瘤细胞凋亡,具有较好的应用价值。

抗禽流感病毒H_5亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制

以禽流感H5 亚型病毒免疫Balb/c小鼠 ,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合 ,用血凝抑制试验检测细胞培养上清 ,结果获得3株阳性细胞株 ,分别命名为4B6、4A3、3H1。经2次亚克隆后 ,100 %杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒H5 亚型抗体的能力。实验证明 ,所有这3株单克隆抗体仅与试验的H5 病毒株反应 ,而不能与禽流感H9 亚型病毒、鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒和鹅腺病毒等反应。间接免疫荧光试验检测结果表明这3株单克隆细胞的培养上清均能与感染H5 亚型病毒的成纤维细胞呈现亮绿色荧光。

抗CXCR4单克隆抗体12G5对阿糖胞苷杀伤HL-60细胞效应的影响

本研究通过观察抗CXCR4单克隆抗体12G5对Ara C杀伤HL-60细胞效应的影响,评价其在白血病骨髓 残留病变中的治疗价值。培养并共培养HL-60细胞,在共培养体系中采用12G5(10μg／ml)阻抑基质细胞SDF-1的 生物作用后,通过MTT法及细胞形态学观察检测不同浓度Ara c对HL-60细胞杀伤作用的变化。药物杀伤效应曲 线显示,在20μg／ml Ara C组,对照组中前2天A540值明显下降,但从3-4天开始出现上升,而加12G5实验组中 A540值虽然下降平缓,但持续下降,并于观察第5天后低于对照组,整个观察期中未出现反弹。在40μg／ml Ara C 组,对照组A540在0-3天明显下降,从第4天开始回升,于第5-6天与实验组曲线交叉,从7-12天时照组A540值 总体呈上升趋势,并明显高于实验组,而加12G5实验组曲线在整个观察期间虽然在7-9天有小幅度攀升,但总的 趋势是下降。细胞形态学观察显示,在两个浓度组,对照组HL-60细胞数量最初明显减少,随着培养时间延长,细 胞数量逐渐增多,实验组结果正相反。结论:12G5减弱Ara C对HL-60细胞的早期杀伤作用,但12G5增强Ara C 总体杀伤作用,同时,延缓HL-60细胞对Ara c的耐药性,因此12G5有助于白血病骨髓残留病变的治疗。

抗白介素5单克隆抗体抑制哮喘小鼠嗜酸性粒细胞迁移

目的观察抗白介素5(IL-5)单克隆抗体对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞(Eos)从骨髓到气道迁移的影响。方法15只雄性C57BL/6小鼠。常规法复制哮喘,并在每次卵白蛋白(Ova)激发前2h鼻腔内滴入抗IL-5单克隆抗体,同时设立阴性对照组,即以生理盐水代替Ova和抗IL-5抗体。在末次抗原激发后12h测定支气管肺泡灌洗液(BALF)、外周血(PB)和骨髓(BM)中炎症细胞数以及肺组织内Eos数。结果Ova抗原激发后12h小鼠的BALF、PB和BM及细支气管和肺组织中的Eos数显著增加(P<0·01,P<0·05)。抗IL-5单克隆抗体则使上述变化显著减轻(P<0·05,P<0·01)。结论抗IL-5单克隆抗体能显著抑制哮喘小鼠嗜酸性粒细胞的迁移。

抗牛边缘无浆体MSP5单克隆抗体的制备

为制备抗牛边缘无浆体膜表面蛋白(MSP5)单克隆抗体(MAb),以原核表达的重组MSP5蛋白(rMSP5)免疫BALB/c鼠,应用常规杂交瘤技术获得2株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株(1D8和2F3)。间接ELISA检测腹水效价分别为5.49×105和7.83×104,亚类鉴定其重链为分别为IgG2b和lgG2a,轻链均为κ型;ELISA叠加试验表明这2株MAb识别的抗原位点相同或相近;Western blot结果显示2株MAb均能与rMSP5发生反应。特异性抗MSP5的MAb的获得,为牛边缘无浆体检测奠定了基础。

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtGP5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。

IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb)。利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDVVP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23ku。Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和westernblot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清Ⅱ型IBDV23/82株VP5反应,不与血清Ⅰ型IBDVGt株VP5反应。腹水抗体间接ELISA效价为1×104。该mAb的制备为研究血清Ⅱ型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础。

小鼠抗人C5aR短肽(9～30)单克隆抗体制备及鉴定

目的获得有生物功能的小鼠抗人 C5 a R短肽单克隆抗体。方法对 C5 a受体 (CD88)二级结构和 B细胞表位进行分析研究 ,采用 Fmoc方案固相合成 C5 a R N-端第 9～ 30位氨基酸残基的 2 2 -肽 ,以此为抗原免疫 Balb/ c小鼠。结果建立了 1株小鼠抗人 C5 a R短肽杂交瘤细胞系 E3,其平均染色体数目为 10 2条 ,所分泌抗体为 Ig G1,κ型 ,腹水抗体效价为 1×10 - 4 ～ 1× 10 - 6 ,可识别 U 937、人脐静脉内皮细胞 (VEC)和 PMN等表达 C5 a R细胞。 E3单抗的亲和常数 Ka=2 .5× 10 5 ,其结合表位为 C5 a R第 15～ 2 1位氨基酸基序 D1 5 DKDTL2 0 D。结论 B细胞表位多肽具有免疫原性 ,可制作单克隆抗体 ,为 C5 a-C5 a R相互作用的研究以及 AL I、ARDS等 C5 a相关疾病的研究提供实验材料。

蓝舌病病毒3型VP5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备血清3型蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用pMAL-C4x原核表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗BTV3 VP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(3F2)。间接免疫荧光结果表明:MAb 3F2与BTV3、BTV5、BTV9、BTV16呈阳性反应;与BTV6、BTV7、BTV13、BTV21呈弱阳性反应;与其它BTV血清型均呈阴性反应。利用原核表达的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合短肽对MAb 3F2识别的抗原表位进行鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为89PGERGIQMKIKEIEEE104。氨基酸序列比对结果显示该表位在不同地域来源的BTV3株间比较保守。该MAb的制备和鉴定为进一步研究VP5蛋白的结构和功能奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定

利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB／c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合，经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆，得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株，分别命名为4C9、5D10、5F12，其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024，腹水的效价为1：3200～1：10240，IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明，这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明，5D10和5F12具有病毒中和活性，中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12，3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体，表明抗GP5蛋白中和性McAb制备成功。