臭鼻克雷伯和鲍曼不动杆菌中检出NDM-1型金属β内酰胺酶基因

目的调查对碳青霉烯类抗菌剂敏感性降低的肠杆菌和鲍曼不动杆菌中NDM-1型金属β内酰胺酶基因的存在情况。方法应用改良Hodge试验和EDTA协同试验对2007～2010年本院收集的对碳青霉烯类抗菌剂敏感性降低的肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行碳青霉烯酶筛选。PCR法扩增NDM-1基因,并对PCR扩增阳性产物进行DNA测序分析。对NDM-1基因阳性菌株用PCR方法检测armA和rmtB16S rRNA甲基化酶基因,VIM、SPM、IMP和KPC碳青霉烯酶基因以及Ⅰ类整合子。Etests法进行药敏试验。结果 70株肠杆菌中10株Hodge Test和EDTA协同试验阳性,55株鲍曼不动杆菌中6株EDTA协同试验阳性。其中1株臭鼻克雷伯和3株鲍曼不动杆菌PCR扩增出NDM-1型金属β内酰胺酶基因目的片段,经测序比对为NDM-1型基因。其中1株臭鼻克雷伯和1株鲍曼不动杆菌检测出armA型16S rRNA甲基化酶基因,1株鲍曼不动杆菌检测出2000 bp左右的Ⅰ类整合子,未检出除NDM-1型外的其他碳青霉烯酶基因。NDM-1基因阳性菌除对替加环素、多黏菌素B敏感外,对其他检测的抗菌剂均耐药。结论臭鼻克雷伯和鲍曼不动杆菌中存在NDM-1型金属β内酰胺酶基因,有的携带armA型16S rRNA甲基化酶基因和Ⅰ类整合子,为该地区首次报道。

产吲哚金黄杆菌金属β-内酰胺酶及其基因型检测

目的了解产吲哚金黄杆菌(Chryseobacteriumindologenes)耐药特性和金属β-内酰胺酶(MBL)的产酶率及其基因型。方法琼脂稀释法检测25株产吲哚金黄杆菌的最低抑菌浓度(MIC),增效法、改良三维试验法进行MBL表型检测,聚合酶链反应(PCR)筛查MBL和整合酶基因,全编码基因检测以及序列分析以确定IND型MBL的基因型;接合试验监测耐药基因是否具有可转移性,等电聚焦电泳(IEF)测定β-内酰胺酶等电点(pI)。结果产吲哚金黄杆菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率为88.0%,但利福平、加替沙星、左氧氟沙星的耐药率均<12.0%;表型检测19株细菌产MBL,PCR初筛检测仅IND-like通用引物扩增出20株阳性,全编码基因分析,blaIND-1型9株,blaIND-2型10株,IND-like型MBL基因1株,其中5株blaIND碱基序列和演绎的氨基酸序列均发生改变;接合试验均为阴性,19株检测到1(17株)或2个(2株)pI值,携带blaIND-1的菌株(CI-5)经IEF和MBL表型检测均为阴性。结论产吲哚金黄杆菌具有很高的MBL检出率,本地区的产吲哚金黄杆菌以产IND-1、IND-2型MBL为主,blaIND可能存在蛋白质的不表达或低水平表达。

产IMP-4型金属β-内酰胺酶多药耐药产酸克雷伯菌耐药基因分析

目的了解产IMP-4型获得性金属β-内酰胺酶产酸克雷伯菌耐药基因存在的状况。方法分别采用K-B法、双纸片增效法、Etest法、聚合酶链反应(PCR)及序列分析方法检测其产金属β-内酰胺酶(MBLs)表型及相关的耐药基因。结果多药耐药产酸克雷伯菌除对阿米卡星、多黏菌素B敏感外,对碳青酶烯类、三代、四代头孢菌素、头孢西丁、氟喹诺酮类、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、利福平等均耐药;金属β-内酰胺酶基因型别为IMP-4型(blaIMP-4)、intⅠ1、qacEΔ1-sul1、aadA1、AmpC(blaADC)、CTX-M-14基因阳性。结论产酸克雷伯菌的多药耐药与整合子相关,且携带有多种耐药基因。

脑膜炎败血黄杆菌体外抗药活性及金属β内酰胺酶基因型研究

目的了解临床分离脑膜炎败血黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)耐药特性和金属β-内酰胺酶(MBL)产酶率及基因型。方法采用琼脂稀释法检测25株细菌对抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),三纸片增效法、改良三维试验法检测MBL表型;并采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析,确定MBL基因型。利用接合试验监测耐药基因的可转移性,等电聚焦电泳(IEF)法测定β-内酰胺酶等电点(pI)。结果25株脑膜炎败血黄杆菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率达72.0%,而对利福平和加替沙星、左氧氟沙星的耐药率均低于16.0%。14株细菌检出产MBL,产酶率为56.0%。MBL全编码基因扩增及序列分析显示,14株细菌共检出17个编码MBL的基因,分别为blaB1,2株;blaB2,5株;blaB3,4株;blaB11,4株;blaGOB-1,1株;blaGOB-10,1株。接合试验均为阴性。结论脑膜炎败血黄杆菌具有严重的多重耐药现象,并具有高MBL检出率。MBL基因可能位于脑膜炎败血黄杆菌的染色体上,不能通过细菌质粒等可移动基因元件发生菌株和菌种间传播。

检测临床分离的产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的基因型

目的:研究铜绿假单胞菌中金属β-内酰胺酶的的基因型及基因的转移机制,为监控产酶菌株的流行及指导临床合理选择抗生素提供依据。方法:E-test筛选对亚胺培南或头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌中的产金属β-内酰胺酶菌株,PCR扩增耐药基因imp、vim、spm和gim。接合试验检测质粒型耐药基因。结果:75株耐亚胺培南和/或头孢他啶的铜绿假单胞菌中21株E-test阳性,PCR检测imp基因阳性菌株11株,vim基因阳性菌株3株,spm基因可疑阳性菌株4株,3株经E-test试验阳性而用特异引物PCR扩增金属酶基因为阴性。接合试验未获得接合子。结论:我院和新疆地区临床分离的铜绿假单胞菌所产金属β-内酰胺酶基因型以IMP型为主。

鲍曼不动杆菌启动子突变TEM-1型β-内酰胺酶基因研究

目的 分析浙江湖州地区临床分离的鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶(BLA)耐药基因序列，并确定其亚型。方法 采用微量稀释法对在2001年1月至2002年12月间自临床分离的39株鲍曼不动杆菌进行药敏试验、三维试验检测ESBLs，采用聚合酶链反应(PCR)技术检测TEM、SHV、OXA、CTX-M、PER及VEB型BLA耐药基因，并对7株TEM基因型阳性的分离株(编号分别为HZ08、HZ09、HZ17、HZ24、HZ35、HZ37、HZ40)进行耐药基因序列分析。结果 39株鲍曼不动杆菌TEM型BLA耐药基因PCR扩增均呈阳性，其余基因PCR扩增均为阴性。7株TEM基因测序结果表明他们的基因片段全长均含1022个核苷酸，经GenBank网上同源性比较，发现这些序列与广谱酶TEM-1(GenBank注册号：AF188200)的编码区域序列相同，但在启动子区域-47位点处均有1个核苷酸发生突变(G→T)。其中HZ40株的TEM-1序列已在GenBank核酸数据库中成功注册(GenBank注册号：AY263331)。HZ08、HZ09、HZ24、HZ35、HZ37和HZ40株ESBLs均阳性，HZ17株ESBLs阴性。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌携带伴启动子区域核苷酸突变的TEM-1亚型BLA耐药基因，此基因可以导致ESBLs表型阳性。

TEM-1型β-内酰胺酶编码基因的克隆表达

目的:构建TEM-l型β-内酰胺酶基因的表达载体。方法:通过PCR扩增TEM-l全编码基因,将其连接入pBK-CMV载体中,并在大肠杆菌JM109中表达。采用琼脂二倍稀释法对TEM-l克隆菌株进行MIC检测,双纸片法筛选及确证实验检测其表型,等电聚焦(IEF)电泳测定其等电点(pIs)。结果:经酶切测序鉴定TEM-l基因的表达载体构建正确。重组菌产pI为5.4的TEM-l广谱酶,仅对青霉素类耐药。结论:TEM-l基因原核表达载体正确构建,为进一步研究打下了基础。

脑膜炎败血黄杆菌产金属β-内酰胺酶的检测及基因型的研究

目的了解杭州市脑膜炎败血黄杆菌的流行及产金属β-内酰胺酶的情况并对其基因型进行研究。方法对100株分离自4所综合性医院的多重耐药脑膜炎败血黄杆菌,用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测金属β-内酰胺酶,用Bla-B和GOB的通用引物对表型试验阳性的菌株进行聚合酶链反应(PCR)和测序分析金属β-内酰胺酶的基因型。并用脉冲场凝胶电泳对其中的菌株进行同源性分析。结果用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测到61株菌株产金属β-内酰胺酶,用Bla-B和GOB通用引物进行扩增和测序,有60株菌株扩增到金属β-内酰胺酶,其中有51株检测到BlaB基因型,有36株检测到GOB基因型。检测到的Bla-B基因型主要为BlaB-1、2、3、5和BlaB-11这5种类型;检测到的GOB基因型主要为GOB-1、2、4、6和GOB-85种类型。其中产生一种金属β-内酰胺酶的有33株,产两种金属β-内酰胺酶的有27株。浙大医学院附属一院和附属二院主要是BlaB-3和BlaB-11型为主,浙大医学院邵逸夫医院主要是GOB-4和GOB-8为主,杭州市中医院主要是GOB-8基因型。其中1菌株表型试验检测阳性而未能检测到基因型,可能为一种新的基因型有待今后进一步研究。经同源性分析,杭州市中医院的菌株具有很好的一致性,而与其他医院的结果完全不同。结论杭州市多重耐药的脑膜炎败血黄杆菌的主要耐药机制之一是产金属β-内酰胺酶,基因型主要为Bla-B和GOB型。4所医院流行的基因型均不相同。而杭州市中医院的脑膜炎败血黄杆菌具有一定的同源性,区别于其他3所医院,表明系院内感染菌。

L1型金属β-内酰胺酶的原核表达及特性研究

目的:对临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β-内酰胺酶基因进行原核表达,并检测多种β-内酰胺类抗生素对重组L1酶的稳定性。方法:PCR扩增L1酶的编码基因,将其亚克隆入pUCm-T载体,测序后将L1基因克隆至表达载体pET-41 a(+)后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,分光光度计测定多种β-内酰胺类抗生素对L1型金属β-内酰胺酶的稳定性。结果:本实验中的L1酶与国外同类酶的氨基酸同源性为92.44%。重组L1酶水解青霉素及碳青霉烯类抗生素的能力接近,氨曲南及头孢他啶对L1酶高度稳定。结论:对L1型金属β内酰胺酶的克隆测序及成功表达为进一步研究该酶的分子生物学特性奠定了基础。抗生素对L1酶的稳定性研究为指导临床合理应用抗生素提供了科学的理论依据。

同时产PER-1型和TEM-1型β内酰胺酶铜绿假单胞菌的检出

目的 分析多重耐药铜绿假单胞菌临床株 (编号 0 10 7)对 β内酰胺类抗生素耐药情况及其原因。 方法 用改良三维试验分析 0 10 7株产生的 β内酰胺酶表型 ,以碱裂解法提取质粒 ,用聚合酶链反应 (PCR)方法扩增质粒的酶基因型别 ,并对阳性产物测序。结果 0 10 7号铜绿假单胞菌临床株产生超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs) ,携有blaPER - 1基因 ,同时还有blaTEM - 1型基因。结论 0 10 7号菌株耐 β内酰胺类抗生素耐药的可能原因是产生PER - 1型的ESBLs和TEM - 1型的广谱酶。

一株同时产OXA-23型碳青霉烯水解酶和PER-1型超广谱β-内酰胺酶的鲍曼不动杆菌

目的 分析多重耐药鲍曼不动杆菌对 β 内酰胺耐药的原因及其耐药基因的转移方式。 方法 用等电聚焦电泳试验和三维试验分析多重耐药鲍曼不动杆菌临床菌株所产 β 内酰胺酶 ,并进行初步分类 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增和产物测序方法确认 β 内酰胺酶基因 ,用PCR扩增整合子全可变区和质粒接合实验来判定其耐药基因的转移方式。结果 该临床菌株产超广谱 β 内酰胺酶 ,经分子生物学方法证实有blaPER 1基因 ,同时还有blaOXA 2 3 基因和aacA4基因。结论 发现一株产OXA 2 3型碳青霉烯酶和可转移的PER 1型超广谱 β 内酰胺酶的鲍曼不动杆菌 ,blaPER

革兰阴性杆菌β-内酰胺酶表型和基因型研究

目的了解铜陵地区临床分离的革兰阴性杆菌产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC酶)和金属β-内酰胺酶(MBL)的分布情况,并检测产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs基因型鉴定。方法采用三维试验检测革兰阴性杆菌产ESBLs和AmpC酶,纸片协同法检测MBL,用聚合酶链反应(PCR)对ESBLs表型阳性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行TEM型、SHV型、CTX-M型三种耐药基因检测并克隆测序。结果356株革兰阴性杆菌检出产酶株90株,检出率25.3%。单产ESBLs革兰阴性杆菌57株,检出率16.0%,以肺炎克雷伯(31.6%)、大肠埃希菌(31.0%)检出率高;单产AmpC酶4株,检出率1.1%,其中阴沟肠杆菌3株;同时产ESBLs和AmpC酶16株,检出率4.5%,以鲍曼不动杆菌(12.5%)检出率最高;产MBL细菌13株,均为非发酵菌,以嗜麦芽窄食单胞菌检出率最高,为71.4%。17株ESBLs表型阳性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌有16株检出ESBLs耐药基因,其中CTX-M型15株(88.2%),TME型13株(76.1%),SHV型2株(11.8%),有11株细菌同时带有两种ESBLs基因,1株带有3种ESBLs基因。结论革兰阴性杆菌产生ESBLs、AmpC酶和MBL多种β内酰胺酶,铜陵地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs基因型以CTX-M型为主。

大肠埃希菌产PER-1型超广谱β-内酰胺酶的研究

目的检测大肠埃希菌产PER-1型超广谱β-内酰胺酶的发生率及其耐药特点。方法采用双纸片增效确证试验进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的表型检测,对表型阳性菌株用聚合酶链反应(PCR)和PCR产物测序方法确定超广谱β-内酰胺酶的基因型。结果167株大肠埃希菌中有50株产ESBLs,占29.9%(50/167);6株产PER-1型ESBLs,占3.6%(6/167)。6株产PER-1型ESBLs大肠埃希菌均对头孢他啶和头孢噻肟耐药,5株对头孢西丁耐药,4株对阿米卡星敏感,全部菌株对亚胺培南敏感。结论大肠埃希菌中检测到产PER-1型超广谱β-内酰胺酶,且其耐药和多重耐药性严重,应引起重视。

PER-1型超广谱β内酰胺酶在革兰阴性杆菌中的流行情况调查

目的:了解PER-1型超广谱β内酰胺酶(ESBLs)在革兰阴性杆菌中的流行情况。方法:采用纸片扩散试验初筛和确证ESBLs表型,用聚合酶链反应(PCR)扩增耐药基因及PCR产物测序验证PER-1型ESBLs。结果:ESBLs的总检出率27.3％(179/656),PER-1型占ESBLs的8.9％(16/179),产酶菌以鲍曼不动杆菌为主。结论:应加强对PER-1型ESBLs的检测,以有效控制由产生该型ESBLs细菌引起的医院感染。

金属β-内酰胺酶(IMP-1)的表达,纯化和鉴定

目的:建立金属β-内酰胺酶IMP-1的表达,纯化和鉴定方法,并探讨实验条件对分离纯化的影响。方法:pET9a/d-IMP-1质粒转化至E.coli Competent BL21(DE3)Cell并在LB培养基中表达后,通过SP Sepharose离子交换柱,得到粗提物,浓缩后用Sephadex G-75凝胶柱进一步纯化,得到IMP-1的精提物,对纯化产物用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS进行鉴定,同时用Nitrocefin作底物,测定纯化的金属β-内酰胺酶IMP-1的活性。结果:纯化的IMP-1具有较高的活性,能水解大多数抗生素。其米氏常数Km=9.28μmol/L;用MALDI-TOF-MS法测得的分子量为Mr=25111.9。结论:本文建立了金属β-内酰胺酶IMP-1的表达、纯化、鉴定方法,该法可用于其它的金属β-内酰胺酶的表达和纯化。

金属β-内酰胺酶基因及其传播机制的研究进展

金属β-内酰胺酶具有水解多种抗生素的能力,编码该酶的基因主要是获得性金属β-内酰胺酶基因,为可移动型基因,迄今已发现包括IMP,VIM型等多种基因型,而且新的基因型和亚型不断出现。金属β-内酰胺酶基因在I类和III类整合子中发现,整合子是其发生水平传播的主要因子,最常见的水平传播方式由整合子通过接合作用完成,整合子及其金属β-内酰胺酶基因的广泛传播与质粒、转座子密切相关。SPM-1型基因可借助于可移动的共同区域(CR)发生转移。

TEM-1型β-内酰胺酶及CarO蛋白介导的耐舒巴坦鲍曼不动杆菌临床株耐药机制研究

目的研究TEM-1型β-内酰胺酶及Car O蛋白介导的鲍曼不动杆菌临床株对舒巴坦的耐药机制。方法将24株非重复鲍曼不动杆菌临床株通过琼脂稀释法分为舒巴坦非敏感组(18株)和敏感组(6株),用纸片扩散法(K-B)行药敏试验,PCR扩增bla_(TEM-1)和car O基因,选取4株bla_(TEM-1)阳性菌株(A3、A5、1327、C1),对其扩增产物测序,BLAST软件分析;应用实时荧光定量RT-PCR技术检测2组菌株bla_(TEM-1)和car O基因m RNA转录情况。结果敏感组临床株对美罗培南、亚胺培南、头孢哌酮、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林耐药率分别为1/6、2/6、3/6、1/6、5/6、5/6;非敏感组分别为6/18、10/18、18/18、18/18、18/18。敏感组未检出bla_(TEM-1),非敏感组中16株临床株扩增出bla_(TEM-1);24株临床菌株全部扩增出car O基因。测序显示4株临床株bla_(TEM-1)基因均未出现有义突变;A3、A5、1327启动序列为P4,C1为P3。BlaTEM-1基因阳性菌株m RNA相对表达量与其对舒巴坦MIC值呈正相关(rs=0.551,P=0.027);car O基因m RNA相对表达在敏感组和非敏感组中无差异。结论临床分离鲍曼不动杆菌受试菌株耐药严重,其对舒巴坦的耐药机制与TEM-1型β-内酰胺酶高表达有关,而bla_(TEM-1)基因启动子调控可能是TEM-1型β-内酰胺酶高表达的原因之一。

新德里金属β内酰胺酶-1序列和抗药性的生物信息学分析

在2009年报导的新德里金属-β-内酰胺酶-1（NDM-1）是“超级细菌”的一种主要的抗药物酶，具有通过基因重组在不同物种间转移的潜力，而且它具有广谱耐药性，目前已知的抗生素中，仅替加环素对其有抑制作用。本文旨在通过生物信息学技术探索NDM-1的基因重组的方式，并利用分子对接方法研究替加环素抑制NDM-1的分子机制。通过对一系列金属-β-内酰胺酶的氨基酸序列的进化树分析，发现三种来自海洋生物的蛋白与NDM-1具有较近的功能类似性，而相应编码基因的进化树分析发现仅其中一种与NDM-1有较近的进化距离。GC含量分析也发现NDM-1上游100～350bp剧烈波动，而在编码区段与该种基因的GC含量较为相似。因此认为NDM-1基因可能通过该基因水平转移的获得其特殊的功能。另外，通过半柔性分子对接，对NDM-1与替加环素的优势结合构象的潜在氢键进行分析，并与另外5种抗生素与NDM-1的对接结果进行比较，初步确定替加环素对于NDM-1蛋白存在竞争抑制优势，从而为NDM-1抑制剂的设计提供有价值的信息。

产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的耐药性和基因检测

目的研究某地区临床分离的铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶株主要基因型及其耐药性。方法以聚合酶链反应(PCR)法检测该市3所医院2002年8月—2007年6月分离的100株耐亚胺培南和(或)头孢他啶铜绿假单胞菌中产金属β-内酰胺酶基因,并用二倍琼脂稀释法检测10种抗菌药物对产金属酶株的体外最低抑菌浓度(MIC)。结果共检出9株金属酶阳性菌株,其中3株IMP-1扩增阳性;6株VIM扩增阳性,经基因测序确认为VIM-2型。产酶株对头孢哌酮、头孢吡肟、亚胺培南、复方磺胺甲口恶唑全部耐药,部分对阿米卡星、环丙沙星较为敏感。结论该地区铜绿假单胞菌流行株金属酶基因型主要为VIM-2型和IMP-1型;其耐药性强,临床应根据药敏结果选择药物联合使用,以达到最佳抗菌效果。

鲍曼不动杆菌的耐药性及β-内酰胺酶基因的研究

目的调查鲍曼不动杆菌耐药特点及β-内酰胺酶基因类型.方法用Phoenix-100系统对细菌进行鉴定和药敏试验.用琼脂稀释法测定头孢噻肟等6种抗生素的最低抑菌浓度;用PCR法检测β-内酰胺酶基因,并对耐药基因测序分析.结果247株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美洛培南耐药率仅为3.2%和4.1%,而对阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦等其余14种抗生素耐药率为31.9%～67.2%.20株多重耐药性鲍曼不动杆菌中17株具TEM基因,任选3株经DNA测序为TEM-1型基因,与GeneBank(χ 54604)比较,共有4处同义突变.未检出SHV、OXA、CTX-M、PER和VEB型β-内酰胺酶基因.结论本地区鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药除与TEM型耐药基因有关外,可能还与其他耐药机制有关.