转化型桔梗皂甙抗IBDV、AIV和NDV的研究

为探索中药桔梗的主要活性成分桔梗总皂甙及其转化型桔梗皂甙的生物学活性和抗IBDV、A IV(H9)、NDV的作用,采用M TT法和间接免疫荧光检测试验,分别研究桔梗总皂甙与转化型桔梗皂甙的细胞毒性、对CEF生长和活性的影响以及抗病毒活性。结果表明:桔梗总皂甙和转化型桔梗皂甙对细胞毒性作用的IC50分别为128.74和53.48μg.mL-1,对CEF细胞生长和活性具有最大促进作用的浓度分别为80和25μg.mL-1。桔梗总皂甙阻断IBDV、A IV(H9)、NDV感染CEF细胞的作用分别为66.3%、55.4%和36.9%,抑制三者增殖的作用分别为69.4%、60.8%和26.2%;转化型桔梗皂甙阻断三者感染CEF细胞的作用分别为84.7%、63.5%和45.5%,抑制三者增殖的作用分别为77.8%、63.5%和41.9%,表明桔梗总皂甙经化学处理转变成转化型桔梗皂甙,可明显提高其生物学活性和抗病毒用。

多重PCR同时检测鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG方法的建立和临床应用

通过建立针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断技术,并进行了特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明:设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG)。说明该多重PCR技术具有较强特异性和较高敏感性,能检测出1pg AIV、1pg NDV、10pg IBV的RNA和1pg ILTV、10pgMG的DNA。对自然感染鸡临床样品检测的结果则证明,该技术在临床诊断方面具有广阔的应用前景。

黄芩苷在鸡胚上对鸡常见病毒AIV、NDV、IBV的作用效果

考察黄芩苷在鸡胚上对鸡常见病毒AIV、NDV、IBV的作用效果,以确定黄芩苷抗病毒的有效浓度。试验共设计2种加药方式,第1组采用最大安全浓度的黄芩苷与鸡胚互作4 h后接种病毒,第2组采用病毒侵染鸡胚4 h后添加最大安全浓度的黄芩苷。结果表明,第1组样品对病毒的阻断效果优于第2组。证明黄芩苷对AIV、NDV、IBV均有一定的抑制作用,在禽病的预防与治疗上具有较高价值。

应用基因芯片技术检测禽4种主要疫病的研究 Ⅱ.检测基因芯片的构建及制备

本试验进行了NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片的构建及制备。以构建的重组质粒为模板，用PCR方法扩增制备靶基因，异丙醇沉淀法进行纯化，制备的靶基因质量浓度可达161．88～1218．36mg／L。将靶基因以点样缓冲液稀释至100mg／L，以芯片点样仪SpotArray24将靶基因点制在氨基化基片上，样点中心间距450／Lm，样点直径220／Lm。点样基片经室温干燥2h、水合处理10s、紫外线交联25min和0．2％SDS洗涤5min等系列处理后，成功制备出检测基因芯片。试验以PCR扩增标记制备检验探针，对制备的检测芯片进行质量检验。结果表明，制备的NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片质量好，可对NDV、IBV、AIV和IBDV进行检测。

一步法多重RT—PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究

为了提高检测鸡肉中新城疫病毒 (Newcastlediseasevirus,NDV)、禽流感病毒 (Avianinfluenzavirus,AIV)、传染性支气管炎病毒 (Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)的效率和敏感性 ,利用引物设计软件PrimerPrimer5.0设计了NDV的F基因片段、AIV的M基因片段、IBV的M基因片段的引物。在以前一步法RT—PCR扩增各种病毒RNA的基础上 ,进行了两种病毒和三种病毒的一步法多重RT—PCR的试验。结果确定了两种病毒的一步法多重RT—PCR的试验条件 ,三种病毒的一步法多重RT—PCR的试验条件基本确立。本试验初步建立了检测NDV、AIV。

胶东地区规模鸡场3种主要病毒感染情况的调查

应用RT-PCR对山东青岛、潍坊和烟台3个地区2008年1月至2009年6月送检的1837份具有呼吸道症状鸡的病料进行新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和H9亚型禽流感病毒(AIV)3种主要病毒感染情况的调查。调查显示,3个地区3种病毒的感染率可达65.76%,其中NDV、IBV和AIV(H9)的平均阳性率分别为12.36%、12.30%和41.10%。青岛地区NDV、AIV(H9)和IBV的阳性率最高,分别为13.45%、17.37%和44.08%。2008年下半年较2008年上半年3种病毒的检出率均有所升高,以AIV(H9)升高最为显著;2009年上半年较2008年上半年AIV(H9)阳性率上升最为明显。3种病毒混合感染的阳性率可达11.00%,以IBV+AIV(H9)和NDV+AIV(H9)二重混合感染临床最为常见。表明山东省胶东地区NDV、IBV和AIV(H9)的感染情况比较普遍,且存在一定程度的混合感染。本调查结果为山东省制定规模鸡场3种疫病的防控措施提供了科学资料。

鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(H9N2)三联灭活疫苗的安全性研究

为证实鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(新支流)三联灭活油乳疫苗的安全性,通过颈部皮下注射接种14日龄来航鸡,每日测定鸡的体重,连续监测28 d,用t检验分析对照组和免疫组体重之间的差异显著性。试验结果表明,免疫接种组和空白对照组体重差异不显著,所制备的新支流三联疫苗不影响鸡的生长性能,对鸡安全。

新流法三联疫苗对马立克氏病活疫苗的干扰研究

为了研究1日龄雏鸡同时免疫新流法三联疫苗与马立克氏病活疫苗对马立克氏病活疫苗免疫效果是否有干扰,试验将1日龄雏鸡分为5组,第1组商品蛋鸡不免疫,第2组SPF鸡不免疫,第3组商品蛋鸡仅免疫马立克氏病活疫苗,第4组商品蛋鸡同时接种新流法三联疫苗与马立克氏病活疫苗,第5组空白对照鸡不免疫,于雏鸡8日龄时对第1~4组用马立克氏病超强毒Md5株进行攻毒,攻毒后90 d内连续观察临床症状、剖检变化及病理组织学变化。结果表明:第1,2组鸡出现精神沉郁、肢体麻痹等临床症状并有部分鸡死亡,对死亡鸡只剖检可见,肝脏、脾脏肿大,全身器官出现肿瘤;对剖检鸡只进行组织病理学观察,可见典型的马立克肿瘤病变。而第3~5组鸡则无任何临床病症出现。说明无论是单独免疫马立克氏病活疫苗或是与新流法三联疫苗同时免疫,均能对鸡只提供良好保护,同时免疫新流法三联疫苗与马立克氏病活疫苗不会影响马立克氏病活疫苗的免疫效果。

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。

禽呼吸道7种病毒多重连接探针扩增检测技术的建立与应用

建立了一种多重连接探针扩增技术(MLPA),能快速区分临床上引起禽呼吸道疾病的7种病原,即禽流感病毒(AIV)H9亚型、AIV H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、禽偏肺病毒(aMPV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)和禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)。对扩增产物进行毛细管电泳分析,结果显示,该方法对不同病原核酸的最低检测极限可以达到5.3×10^0~1.40×10^2拷贝/反应,特异性好,探针之间无交叉反应。应用MLPA方法对122份临床样品进行检测,并与国家或行业标准进行比较,结果显示AIV H7亚型、NDV、aMPV、IBV、ILTV的特异性和敏感性均达到100%。结果与国家或行业标准PCR方法的检测结果一致性高,且克服了国家或行业标准PCR方法无法进行多重检测的缺点。该方法最多可同时检测40多种病原,对于复杂症候群的快速和高通量检测具有重要临床意义,可推广到其他多重病毒的检测中,显示出广阔的应用前景。