新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物 ,通过反转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)获得新城疫病毒 (NDV) Lasota株的血凝素神经氨酸酶 (HN)基因片段 ,其长度约为 1 .7kb,与已报道的 NDV-HN基因片段大小一致。再将该 HN基因片段定向插入真核表达质粒 pc DNA3中 ,经酶切和测序鉴定 ,表明构建的重组质粒含有 NDV-HN基因片段。

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。

鸡新城疫病毒(NDV)HN蛋白基因核酸疫苗的构建与血凝活性测定

将NDV弱毒株长春株表面糖蛋白HNcc基因和强毒株四平株HNsp分别插入到核酸疫苗质粒pIRES1中 ,置于CMV启动子的调控之下 ,构建成核酸疫苗表达质粒pIRHNC 及pIRHNS。经酶切鉴定插入正确后 ,用脂质体法转染BHK细胞 ,并于转染后 2 4h、4 8h、72h和 96h收获细胞 ,同时用G4 18进行筛选 ,待筛选细胞长成单层后收获一次细胞。取细胞裂解液检测其血凝活性。通过血凝试验表明两核酸疫苗质粒中的HN蛋白基因均获得表达并具有类似与天然蛋白的蛋白活性 ,且G4 18筛选后表达量高于筛选前的表达量 ,HNC活性略高于HNS。

鸡源NDV WF00C株F基因的测序与蛋白特性分析

用鸡源新城疫病毒凤阳分离株WF00C对9-10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF00C病毒的F基因,获得了1条1.7kb的特异性条带。用PCR产物直接测序。测序结果表明,扩增片段大小为1782bp,含有1个1662bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF00C株与国内外其他NDV F基因的同源性为84.8%-97.5%,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为87.1%,说明WF00C与国内外的传统毒株有较大变异。与Taiwan95株和J株的同源性为94.1%和97.5%,说明WF00C与Taiwan95株和J株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117,表明为NDV的强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒株相比没有太大的变异。

NDV江苏分离株F基因的克隆与序列分析

为比较NDV江苏分离株的遗传变异特征,应用RT-PCR扩增出新城疫病毒(NDV)江苏徐州株(JSXZ)、江苏宿州株(JSSZ)、江苏连云港株(JSLYG)和江苏淮安株(JSHA)的融合蛋白F基因的全长核苷酸,将其分别克隆至pMD18-T载体中。将获得的阳性重组质粒进行序列测定后,推导出其氨基酸序列,进行分析和比较。结果表明,所获得的4个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1662bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;4个毒株与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有69.3%~80.8%。JSXZ株和JSSZ株F基因的裂解位点为112-RRQK/RRF-117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征。以1bp^374bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,JSXZ和JSSZ株NDV为基因Ⅷ型,JSLYG和JSHA株NDV为基因Ⅸ型。

不同基因型NDV灭活油乳苗与La Sota株灭活油乳苗的免疫效果比较

用地方分离的基因Ⅵ型和Ⅶ型代表株 (LD - 3- 0 0株和LD - 7- 0 2株 )配以传统的LaSota株所制备的灭活油乳苗与LaSota株单价灭活油乳苗进行的免疫效果比较显示 :前者在接种后各个时期所产生的HI抗体效价与LaSota株灭活苗免疫鸡所产生的HI抗体效价无明显差异 ,至接种后第 4 2天两者均具有 7.3log2 的HI效价。在对具有不同HI抗体水平的试验鸡进行的攻毒试验中 ,对F4 8E9标准强毒株的攻击 ,无论是LaSota株疫苗免疫鸡 ,还是不同基因型灭活苗免疫鸡 ,在HI抗体效价为 6log2 以上时均能 10 0 %地被保护 ;但对不同基因型野毒株的攻击 ,尤其是基因Ⅶ型野毒株的攻击 ,2种疫苗则呈现出明显的差异。在LaSota株疫苗免疫鸡HI效价为 6log2 时 ,对不同基因Ⅶ型野毒株的攻击 ,保护率只有 0～ 2 0 % ;而具有 6log2 效价的不同基因型疫苗免疫鸡则对不同基因Ⅶ型野毒株的攻击具有 6 0 %～ 70 %的保护率 ;当HI效价达 8log2 左右时 ,LaSota株疫苗免疫鸡对基因Ⅶ型野毒株的攻击也只有 80 %的保护率 ,而不同基因型疫苗免疫鸡已能 10 0 %地被保护 ;LaSota株疫苗免疫鸡只有在HI效价在 9log2 以上时 ,方可 10 0 %地抵抗基因Ⅶ型野毒株的攻击。

对一株NDV分离毒株全基因序列的测定及分析

新城疫病毒(NDV)基因组为单股负链RNA分子,全长大约15 kb,其编码基因顺序为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'[1],6个结构基因之间由不同长度的基因间隔区别开,依次编码6种病毒蛋白,分别为核衣壳蛋白、基质蛋白、血凝素-神经氨酸酶、磷蛋白、大蛋白和融合蛋白。除此之外,还有V和W蛋白,它们与磷蛋白具有相同的N末端不同的C末端。本试验对一株新城疫最新分离毒株进行基因组长度测序,以此为依据对NDV病毒整个基因组不断演化过程进行进一步的研究探索。

NDV基因型与其毒力、现有疫苗免疫保护之间的关系

新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的侵害禽类的急性接触性传染病，该病自1926年首次在英格兰新城（Newcastle）和印尼的爪哇爆发后．至今一直在世界范围内广泛流行，严重威胁养禽业的发展。目前La Sota、Ⅰ系等活疫苗和灭活苗的应用．在ND的防治中发挥了重要作用。尽管如此，由于近年来ND的流行和发病特点发生了很大变化．以非典型为主．

共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDVF和IBDVVP0基因重组鸡痘病毒（重组鸡痘病毒vFV282）接种10日龄～11日龄SPF鸡胚，连续传10代，分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞，分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上，连续传8代，对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定。结果表明，重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后，其毒力未返强，F基因和VP0基因未发生缺失和变异。

4株NDV分离株F基因的克隆与序列分析

对4 株具有一定代表性的NDV(新城疫病毒)分离株的F基因进行RT PCR(反转录聚合酶链反应)扩增和序列分析,根据基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中1 株属于弱毒株,3 株属于强毒株;核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明,3株强毒株与Clone30 基因核苷酸序列的同源性在83.6%~84.0%之间,与F48 E9典型NDV强毒株同源性在86.5.6%~88.3%之间,推导的氨基酸序列同源性与Clone 30 株在85.9%~87.0%之间,与F48E9典型NDV强毒株在89.1%~91.3%之间;利用MegAlign软件绘制了NDV 的系统发育进化树,结果表明, 3株分离强毒株为Ⅶ基因型,弱毒株为基因Ⅱ型。

NDV分离株F基因序列分析及其部分抗原表位的原核表达

为了对山东省滨州市周边地区6株新城疫流行情况进行研究,试验对不同毒株的治病力进行测定,采用RT-PCR技术扩增F基因,利用Meg Align软件进行序列分析,同时克隆DZNDV/007株F蛋白的两个抗原表位F72和F161,构建两个融合表达质粒p ET-32a-F72和p ET-32a-F161,并对其进行诱导表达及Western-blot分析。结果表明:5株属于基因Ⅱ型,为弱毒株;1株属于基因Ⅶ型,为强毒株;IPTG诱导得到两个大量表达的融合蛋白His-F72和His-F161,且具有良好的反应原性。说明新城疫基因Ⅶ型毒株已成为我国的主要致病毒株。

基因Ⅶ型NDV强毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析

运用一步法RT-PCR扩增两株高致病力NDV分离株的F基因重要功能区,并进行序列测定。序列分析表明其在F蛋白裂解位点氨基酸顺序均为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符,且具有101位的K(赖氨酸)和121位V(缬氨酸)两个特征性氨基酸,与基因Ⅶ型NDV的特征完全相符[1]。与疫苗株lasota进行序列比较,并构建了系统发育树,结果表明两株病毒核苷酸同源性达96.6%,与lasota同源性为63.7%,从分子水平揭示了这两个毒株抗原性与常用疫苗株Lasota差异较大的原因。

基于F基因的统一命名法减少NDV分型差异

新城疫病毒（NDV）或禽1型副黏病毒（APMV-1）包括了多个具有单链负股RNA基因组的病毒。长期以来,同时采用2个系统对NDV分离株进行谱系或基因型分类,导致命名混乱和基因群归类的差异。因此,美国农业部农业研究服务署的科学家评估了APMV-1的基因差异，提出了一个统一的命名法，采用这种基于客观标准建立的分类系统将NDV进行基因分型。

新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析

采用异硫氰酸胍 /酚 /氯仿抽提一步法 ,提取新城疫病毒 ( NDV) F4 8E9株及 2个东北地区分离株 DB3、DB5基因组 RNA,并以其为模板经反转录合成 F基因 c DNA第 1链 ,再利用 PCR技术分段扩增出 F基因的c DNA。F4 8E9、DB3和 DB5株 F基因的 c DNA经酶切修饰后 ,插入 p UC1 9的多克隆位点中 ,转化感受态 E.coli DH5α。经相对分子质量比较、酶切分析及 PCR等鉴定方法筛选出 F4 8E9、DB3和 DB5株 F基因的阳性克隆。然后采用 Sanger′s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,证实分别获得了 F4 8E9、DB3和 DB5株 F基因的全长 c DNA。利用 DNASIS及 MEGA分析软件 ,将上述 3个毒株的 F基因序列与基他 1 1株有代表性的 NDV的相应序列进行比较分析 ,并绘制了 1 4株 NDV F基因的系统发育进化树。结果表明 ,F4 8E9和 DB3株在核苷酸序列上相对独立于 Toyoda等所分的 A、B、C组 ,单独成为一组 ;DB5株与B1 Hitchner株同属 B组 ,说明它们具有较高的同源性。同时也证明我国有不同基因型的毒株在流行。从进化的角度来看 ,NDV各毒株间确实存在遗传变异 ,但

NDV长春株和四平株HN/F核酸疫苗的构建及表达

将新城疫病毒 (NDV)长春株和四平株 HN插入 p IRES1多克隆位点 (Eco R )中 ,构建成核酸表达疫苗 p IRc HN和 p IRs HN,然后切除 p IRc HN和 p IRs HN的新霉素基因 ,将长春株和四平株 F基因分别插入其中 ,构建成 p IRc HNF和 p IRs HNF,而后分别转染 Hela细胞。经血凝效价测定、Western blot分析 ,弱毒株构建的核酸疫苗的血凝活性比强毒株高 1个数量级 ,Hela细胞表达的 HN蛋白量以 p IRc HN最高 ,p IRs HN次之 ,p IRc HNF和 p IRs HNF较低。将重组疫苗转染 Hela细胞 ,用兔抗鸡 Ig Y进行间接免疫荧光试验 ,结果 ,在细胞膜和细胞浆中观察到了特异性的黄绿色荧光 ,证明表达产物具有特异性。

应用基因芯片技术检测禽4种主要疫病的研究 Ⅱ.检测基因芯片的构建及制备

本试验进行了NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片的构建及制备。以构建的重组质粒为模板，用PCR方法扩增制备靶基因，异丙醇沉淀法进行纯化，制备的靶基因质量浓度可达161．88～1218．36mg／L。将靶基因以点样缓冲液稀释至100mg／L，以芯片点样仪SpotArray24将靶基因点制在氨基化基片上，样点中心间距450／Lm，样点直径220／Lm。点样基片经室温干燥2h、水合处理10s、紫外线交联25min和0．2％SDS洗涤5min等系列处理后，成功制备出检测基因芯片。试验以PCR扩增标记制备检验探针，对制备的检测芯片进行质量检验。结果表明，制备的NDV—IBV—AIV—IBDV检测基因芯片质量好，可对NDV、IBV、AIV和IBDV进行检测。

含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组腺病素的构建及鉴定

目的：构建表达新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（Hemagglutinin—neuramidinase，FIN）基因的重组腺病毒，为进一步研究HN基因对消化道肿瘤的抑制作用及分子机制建立基础。方法：用BamHI和XbaⅠ双酶切质粒pVHN，将获得的HN基因片段连接入穿梭质粒pacAd5 CMV K-N pA，构建含HN基因的穿梭质粒pacAd5-HN。利用PacI单酶切对pacAd5-HN和腺病毒基因组质粒（pAd5）进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞，分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定，并测定所获得重组病毒的滴度。结果：所构建重组病毒可有效表达HN基因，表达产物分子量约为63kD，重组病毒滴度为10^8～10610PFU／ml。结论：成功构建含HN基因的重组腺病毒，所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求。

靶向新城疫病毒L基因(功能区)的siRNA抑制新城疫病毒的复制

本研究以新城疫病毒(NDV)L蛋白的功能区(P1595、P2103和P3277酶活性中心结构区)序列为RNAi的靶位点,设计、构建了3个特异性的siRNA的真核表达质粒pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9,转染到CEF细胞后接种NDV,间接免疫荧光实验结果显示:pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9均能抑制NDV抗原蛋白的表达;Real-timePCR检测到转染pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9的CEF细胞中L基因的转录水平分别降低79.1%、93.9%和91.3%,P基因的转录水平分别降低73%、86.3%和89.8%;病毒滴度测定表明转染pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9质粒的细胞培养上清中病毒的滴度分别低2.19、3.16和5.24倍。本研究中3个特异性的siRNA均能抑制NDV的复制、增殖,表明P1595、P2103和P3277这3个区域对于L蛋白发挥RNA依赖的RNA聚合酶的功能具有重要作用。