CRISPR/dCas9-KRAB系统沉默猪LncRNA-NEAT1基因

本研究利用RT-PCR检测LncRNA-NEAT1基因表达在细胞中的亚定位,采用5′RACE获得LncRNA-NEAT1基因的转录起始位点;利用CRISPOR软件对-300~0 bp区域的LncRNA-NEAT1启动子序列设计sgRNA并构建到px330载体,通过转染细胞与T7E1酶切验证sgRNA效率;利用酶切和亚克隆方法将dCas9-KRAB-BSD片段替换px330载体的Cas9序列,形成重组px330-dCas9-KRAB载体;将验证有效的sgRNA构建到px330-dCas9-KRAB载体,形成px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体。添加不同质量浓度的Blasticidin S处理细胞,以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度。转染px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体并用Blasticidin S筛选细胞7 d后进行LncRNA-NEAT1基因的表达检测,同时对sgRNA在LncRNA-NEAT1基因启动子上的结合位点进行Sanger测序,以进一步验证上述结合位点是否发生切割。结果显示LncRNA-NEAT1主要表达于细胞核,而在细胞质中几乎不表达。5′RACE获得了LncRNA-NEAT15′端大约270 bp的序列。qPCR检测结果显示,与对照组相比,sgRNA1和sgRNA2能够显著抑制LncRNA-NEAT1的表达(P<0.05)。Sanger测序结果表明sgRNA1和sgRNA2所在的位点并没有发生碱基缺失和插入。研究结果为后续进一步研究LncRNA-NEAT1在先天性免疫反应中的功能奠定了基础。

lncRNA NEAT1过表达促进破骨细胞分化并抑制成骨细胞分化诱发骨质疏松

目的:研究长链非编码RNA NEAT1在骨质疏松症中的表达及对成骨细胞和破骨细胞分化的作用。方法:收集正常人和骨质疏松症患者的骨组织,运用Real-time PCR检测NEAT1的表达水平。在卵巢去势(OVX)和鼠尾悬吊(TS)诱导的小鼠疏松股骨中,在小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1和人间充质干细胞h MSC向成骨分化过程中以及小鼠巨噬细胞系RAW264.7向破骨分化过程中,检测NEAT1的表达水平。利用敲低Neat1的慢病毒感染MC3T3-E1和RAW264.7细胞,分别采用碱性磷酸酶(ALP)染色确定成骨细胞活性以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞活性变化。结果:NEAT1在患者疏松的骨组织中、小鼠的疏松股骨组织中以及RAW264.7细胞破骨分化过程中表达明显增多;而在MC3T3-E1和hMSC成骨分化过程中表达明显降低。ALP染色显示敲低Neat1显著加重成骨细胞活性,TRAP染色显示敲低Neat1显著抑制破骨细胞活性。结论:长链非编码RNA NEAT1在成骨分化过程中低表达,在破骨分化过程中过表达,并通过促进破骨细胞分化及抑制成骨细胞分化诱发骨质疏松。

长链非编码RNA NEAT1在妇产科疾病中的研究进展

核斑点旁组装转录1(NEAT1)是近年来发现的一种新型长链非编码RNA(lncRNA),由多发性内分泌肿瘤Ⅰ型转录位点转录生成。NEAT1可通过参与调节肿瘤细胞生长、迁移、侵袭、转移等,驱动肿瘤的发生和发展,是新型的诊断生物标志物和治疗靶标。本文对NEAT1在妇产科疾病中的研究进展进行综述,系统分析NEAT1在妇产科疾病发生发展中的作用机制,以期为妇产科疾病的病因机制研究及靶向治疗提供新的思路。

人脐带间充质干细胞向肝细胞分化过程中长链非编码RNA核富集转录本1的作用

背景:人脐带间充质干细胞在体外借助细胞因子可以诱导分化为肝样细胞,但是形成的肝样细胞功能上尚不够成熟。研究发现长链非编码RNA与细胞分化关系密切,并通过干预某些长链非编码RNA的表达达到了促进细胞分化的目的。目的:探讨长链非编码RNA核富集转录本1对人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的影响。方法:建立人脐带间充质干细胞向肝细胞分化体系,用糖原染色和吲哚菁绿摄取实验评价肝细胞功能特性,qRT-PCR检测肝细胞特异性基因及核富集转录本1的mRNA表达。然后通过构建慢病毒干扰核富集转录本1表达,转染7 d后得到稳定转染的细胞株,然后进行肝向诱导分化4周,设立转染空质粒的阴性对照组,未进行病毒转染的对照组,qRT-PCR、Western blot检测肝细胞特异性基因和蛋白表达。结果与结论:①经糖原染色后可见细胞胞质内有红、紫色糖原颗粒,吲哚菁绿摄取后可见大量深绿色吲哚菁绿阳性细胞;②随着诱导时间延长,白蛋白、细胞色素酶P4503A4 mRNA表达量逐渐增加,核富集转录本1的mRNA表达量逐渐降低;③与阴性对照组和未转染对照组比较,在干扰核富集转录本1表达后,白蛋白、细胞色素酶P4503A4 mRNA和蛋白表达均明显增加;④结果表明,长链非编码RNA核富集转录本1可能参与了人脐带间充质干细胞向肝细胞的分化。

LncRNA NEAT1在肺部疾病中的研究进展

长链非编码RNA(LncRNA)广泛参与细胞内染色质修饰、转录调节、核内运输、蛋白功能调节等多种生物学过程,与机体免疫、代谢等多种关键生理功能密切相关。NEAT1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1)是一种新近发现的LncRNA,为构成细胞核亚结构小体旁斑的重要成分,已被证实能够通过与多种miRNA结合调控其下游蛋白表达,进而调节炎症因子的表达、上皮-间质转化、自噬、凋亡、增殖、迁移等生物学过程,其异常表达在肺部疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺炎、肺纤维化、肺癌)的发病过程中发挥重要作用,并且与非小细胞肺癌的预后及抗肿瘤药物敏感性密切相关,有望成为新的生物学标志物及治疗干预靶点。本文主要就NEAT1在肺部疾病中作用的最新研究进展进行综述。