BTK通过NEK7-NLRP3信号通路对小鼠阿尔茨海默样病变的调控作用

目的:本研究探讨布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)对阿尔茨海默样病变及NIMA相关激酶7(NEK7)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的调控作用。方法:选取2、4、6月龄的5xFAD阿尔茨海默病(AD)模型小鼠和野生型(WT)小鼠,采用Western blot检测脑内BTK、NEK7及NLRP3等蛋白水平,免疫荧光染色法检测BTK、NEK7及NLRP3等蛋白的表达,免疫沉淀法检测NEK7和NLRP3的相互作用;选取3月龄5xFAD小鼠,随机分为BTK抑制剂依鲁替尼处理组和溶剂对照组,腹腔注射依鲁替尼(10 mg/kg)或溶剂连续14 d,随后进行Morris水迷宫和Y迷宫行为学实验分析各组小鼠学习与记忆能力;采用β-淀粉样蛋白42(Aβ_(42))侧脑室注射法构建AD模型,注射14 d后进行Morris水迷宫实验,Western blot检测脑内BTK蛋白水平;在BV2细胞中分别使用依鲁替尼预处理脂多糖(LPS)诱导的神经炎症模型或者Aβ_(42)刺激的AD细胞模型,Western blot检测细胞NEK7、NLRP3、BTK以及p-BTK(Y223)蛋白水平的变化,免疫荧光染色法检测炎症小体,包括ASC、caspase-1、NEK7及NLRP3等蛋白的表达。结果:与WT组小鼠相比,5xFAD小鼠脑内炎症小体通路相关蛋白表达增加,NEK7蛋白表达增加,NEK7与NLRP3之间存在相互作用,AD模型小鼠脑内BTK蛋白围绕4G8斑块表达,表达量增加,且与Iba1存在共定位现象;与AD模型组小鼠相比,BTK抑制剂依鲁替尼处理组小鼠学习记忆功能有所改善;细胞实验结果显示,依鲁替尼预处理有效的抑制了Aβ_(42)刺激后BV2细胞NLRP3炎症小体通路相关蛋白以及NEK7的表达。结论:BTK能够通过NEK7-NLRP3相互作用介导神经炎症,抑制BTK可减轻神经炎症、从而改善阿尔茨海默样病变小鼠的学习记忆功能。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达的影响

目的探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠NLRP3信号通路白细胞介素(IL)-1β、IL-18表达的影响。方法从40只SD大鼠随机选取10只作为正常组,其余大鼠自由饮用5%硫酸葡聚糖溶液7 d制备UC大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、柳氮磺吡啶组和健脾益肠散组,每组10只。健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组予相应药液灌胃,正常组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续14 d。观察大鼠一般状况,并进行疾病活动指数(DAI)评分,ELISA检测大鼠血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-l)含量,免疫组化染色、Western blot和RT-PCR检测结肠组织IL-1β、IL-18蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠一般状况较差,DAI评分显著升高(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量显著增加(P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,健脾益肠散组和柳氮磺嘧啶组大鼠一般状况明显好转,DAI评分显著降低(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量明显减少(P<0.05,P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论健脾益肠散可抑制NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达,改善结肠免疫炎症损伤,发挥治疗UC作用。

基于NLRP3信号通路探究天麻素注射液联合神经节苷脂辅助治疗脊髓损伤的可能机制

【目的】基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路探究天麻素注射液联合神经节苷脂辅助治疗脊髓损伤(SCI)的可能机制。【方法】将108例SCI患者随机分为观察组和对照组,每组各54例。2组患者均给予常规康复训练,在此基础上,对照组给予神经节苷脂治疗,观察组给予天麻素注射液联合神经节苷脂治疗。30 d为1个疗程,连续治疗2个疗程。比较2组患者的肌力恢复正常时间、可下地行走时间和留院观察时间,观察2组患者治疗前后美国脊柱损伤协会(ASIA)评分及血清脑源性神经生长因子(BDNF)、中枢神经特异性蛋白(S-100β)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18及NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ACS)水平的变化情况,并评价2组患者的临床疗效及安全性。【结果】(1)治疗2个疗程后,观察组的总有效率为83.33%(45/54),对照组为66.67%(36/54),组间比较(χ2检验),观察组的疗效明显优于对照组(P<0.05)。(2)治疗后,观察组的肌力恢复正常时间、可下地行走时间及留院观察时间均较对照组明显缩短(P<0.01)。(3)治疗1个和2个疗程后,2组患者ASIA的痛觉、运动、触觉评分均较治疗前明显升高(P<0.05),且治疗2个疗程后又较治疗1个疗程后升高(P<0.05);组间比较,观察组在治疗1个和2个疗程后对ASIA的痛觉、运动、触觉评分的升高幅度均明显优于对照组(P<0.05)。(4)治疗1个和2个疗程后,2组患者的血清BDNF水平均较治疗前升高(P<0.05),NLRP3、ACS、Caspase-1蛋白和血清IL-1β、IL-18、S-100β水平均较治疗前下降(P<0.05),且治疗2个疗程后血清BDNF水平又均较治疗1个疗程后升高(P<0.05),NLRP3、ACS、Caspase-1蛋白和血清IL-1β、IL-18、S-100β水平又均较治疗1个疗程后下降(P<0.05);组间比较,观察组在治疗1个和2个疗程后对血清BDNF水平的升高幅度及对NLRP3、ACS、Caspase-1蛋白和血清IL-1β、IL-18、S-100β水平的下降幅度均明显优于对照组(P<0.05)。(5)治疗过程中,2组患者均未出现药物相关不良反应。【结论】天麻素注射液联合神经节苷脂治疗SCI患者疗效确切,可通过调控炎症小体NLRP3信号通路,减轻神经炎症反应,促进神经功能恢复,其疗效优于单纯神经节苷脂治疗。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉性心脏病小鼠心肌保护作用

目的 研究基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)小鼠心肌保护作用。方法 50只6周的雄性SD小鼠中取10只作正常对照组,其余小鼠给予高脂饮食建立CHD模型。采用随机数字表法将40只模型小鼠分为模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组,每组各10只。黄连解毒汤低、中、高剂量组每日分别以10、20、40 g/kg剂量进行灌胃,每日1次,持续6周;正常组、模型组每日给予等量蒸馏水灌胃。干预后采用生化法检测各组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平,酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、内皮素水平;采用苏木精-伊红染色法观察小鼠心肌细胞病理形态,蛋白质印迹法检测心肌组织中TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。比较各组小鼠血脂、心肌组织中抗氧化相关指标和TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。结果 模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组血脂水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低剂量组与模型组血脂水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);黄连解毒汤中、高剂量组总胆固醇、甘油三酯、LDL水平均低于模型组,HDL水平高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组心肌组织中SOD水平均低于对照组,丙二醛、内皮素水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组SOD水平均高于模型组,丙二醛、内皮素水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组心肌纤维排列整齐,横纹清晰且细胞完整,无细胞肿胀、炎症浸润等;模型组心肌纤维排列紊乱,结构发生异常,有严重细胞肿胀、炎症浸润;黄连解毒汤低、中、高剂量组未见心肌纤维断裂,黄连解毒汤中、高剂量组细胞肿胀和炎症浸润情况优于黄连解毒汤低剂量组,黄连解毒汤高剂量组优于黄连解毒汤中剂量组。模型组、黄连解毒汤中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。且黄连解毒汤各剂量组中以上指标变化呈剂量依赖性。结论 黄连解毒汤能降低CHD小鼠血脂水平,保护心肌细胞,其能够通过下调组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达以调节血脂水平并改善心肌功能,且黄连解毒汤的效果随着剂量的增加而增强。

附子理中丸通过调节NLRP3炎症小体信号通路对化疗性恶心呕吐异食癖大鼠的改善作用

目的探讨附子理中丸对顺铂诱导的化疗性恶心呕吐(CINV)异食癖大鼠的药效及其作用机制。方法大鼠随机分为空白组、模型组、帕洛诺司琼组(0.045 mg/kg)及附子理中丸高、中、低剂量组(4.86、2.43、1.215 g/kg),每组8只。预防性给药7 d后,除空白组外,其余各组单次腹腔注射顺铂(6 mg/kg)建立异食癖恶心呕吐模型。造模72 h后(末次给药1 h后)取材,HE染色观察大鼠胃窦和回肠组织病理变化,生化法检测大鼠血清SOD活性及NO、MDA水平,ELISA法检测大鼠肾组织IL-1β、TNF-α水平及回肠组织5-HT、5-HIAA水平,Western blot法检测回肠组织中NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠高岭土摄入量升高(P<0.01),体质量降低(P<0.01),胃窦及回肠组织病理损伤明显,SOD活性及NO水平降低(P<0.05),MDA、IL-1β、TNF-α、5-HT、5-HIAA水平升高(P<0.01),回肠组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,附子理中丸各剂量组及帕洛诺司琼组高岭土摄入量降低(P<0.05),体质量升高(P<0.05),胃窦及回肠组织病理损伤减轻,SOD活性及NO水平升高(P<0.05),MDA、IL-1β、TNF-α、5-HT、5-HIAA水平降低(P<0.05),回肠组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.01)。结论附子理中丸能防治CINV,纠正顺铂诱导的大鼠异食癖行为,其机制可能与抑制NLRP3/ASC/caspase-1通路激活、调节炎症因子释放、抗氧化应激、抑制5-HT生成有关。

甲基莲心碱通过调节AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻慢性皮肤溃疡大鼠的炎症反应

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对慢性皮肤溃疡(CSU)大鼠炎症反应的影响。方法:将90只大鼠随机分为空白对照组(NC组)、CSU组、Nef组、AMPK抑制剂(Compound C)组、Nef+Compound C组,每组18只大鼠。除NC组外的其他各组大鼠通过剪开创口注射氢化可的松以及喷洒金黄色葡萄球菌构建CSU大鼠模型。造模完成后,Nef组和Compound C组分别将20%Nef、10μmol·L^(-1) Compound C与50 mL的20%高渗盐水凝胶混合敷在伤口处,Nef+Compound C组将20%Nef和10μmol·L^(-1) Compound C一起添加到20%高渗盐水凝胶中敷在伤口处,持续治疗2周,NC组、CSU组用等量盐水凝胶处理伤口。观察大鼠皮肤创面愈合情况;ELISA法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-8、TNF-α水平;水解法检测创面肉芽组织中羟脯氨酸(HyP)水平;HE染色检测肉芽组织病理学变化;Western blotting检测CCL4、CCL2、CXCL12以及AMPK/mTOR/NLRP3信号通路蛋白表达水平。结果:CSU组大鼠可看到新生肉芽组织,并且有大量炎症细胞浸润现象,CSU组较NC组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CSU组相比,Nef组创面愈合率、HyP含量、p-AMPK/AMPK蛋白水平显著增加(P<0.05),IL-1β、IL-8、TNF-α含量、CCL2、CXCL12、CCL4、mTOR、NLRP3蛋白水平显著下降(P<0.05),而Compound C组趋势相反(P<0.05);Compound C消除了Nef对CSU大鼠炎症反应的减轻作用。结论:Nef可能通过调控AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻CSU大鼠炎症反应。

大黄蛰虫丸调节IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路对动脉粥样硬化大鼠主动脉炎性损伤的影响

目的 探讨大黄蛰虫丸调节IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路对动脉粥样硬化(AS)大鼠主动脉炎性损伤的影响。方法 将40只大鼠分为正常对照组(NS)、模型组、地奥心血康干预组(阳性组)及大黄蛰虫丸干预组(大黄蛰虫丸组),每组各10只。除正常组外,余下3组小鼠均构建AS模型。应用油红染色对主动脉病理切片情况进行观察,采用EILSA法检测血清脂质水平[甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]、血清炎症指标(IL-6、IL-1β、TNF-α水平);应用流式细胞术对外周血Th17/Treg细胞水平进行检测,并通过RT-qPCR法和Western blot分别检测IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路mRNA和蛋白表达水平,并计算AI指数。结果 除NC组大鼠以外,其他各组大鼠动脉组织中均出现内膜增厚、斑块沉积和不连续、大量炎症细胞浸润等现象;其中模型组动脉组织损伤现象最为显著,阳性组和大黄蛰虫丸组较模型组明显改善,动脉组织结构情况与NC组相近。模型组血清TC[(9.82±1.46)mmol/L]、TG[(9.82±1.46)mmol/L]、LDL-C[(2.93±0.22)mmol/L]、IL-6[(97.65±9.11)ng/L]、TNF-α[(93.21±11.17)ng/L]水平及外周血Th17[(3.56±0.34)%]、Treg细胞[(4.41±0.38)%]水平高于NC组[分别为(3.71±0.57)mmol/L、(6.47±0.92)mmol/L、(0.94±0.15)mmol/L、(16.52±2.76)ng/L、(5.45±0.84)ng/L、(1.83±0.16)%、(7.72±0.73)%](均P<0.05),HDL-C水平[(2.92±0.31)mmol/L]低于NC组[(0.95±0.08)mmol/L](P<0.05);与模型组相比,大黄蜇虫丸组和阳性组血清TC[分别为(3.92±0.72)mmol/L、(3.71±0.65)mmol/L]、TG[分别为(6.71±0.83)mmol/L、(6.83±0.72)mmol/L]、LDL-C[分别为(1.15±0.11)mmol/L、(1.11±0.13)mmol/L]、IL-6[分别为(19.83±2.55)ng/L、(18.51±3.72)ng/L]、TNF-α[分别为(17.08±1.72)ng/L、(15.92±1.56)ng/L]水平及外周血Th17[分别为(2.11±0.25)%、(2.06±0.22)%]、Treg细胞[分别为(7.45±0.76)%、(7.31±0.72)%]水平偏低,HDL-C偏高[分别为(2.18±0.72)mmol/L、(2.23±0.61)mmol/L],趋近于NC组(均P<0.05)。与NC组AI指数(0.35±0.08)比较,模型组、阳性组和大黄蛰虫丸组(分别为9.71±2.04、1.21±0.15、0.83±0.17)均明显升高(均P<0.05),其中阳性组和大黄蛰虫丸组AI指数低于模型组(均P<0.05)。模型组大鼠的IL-6、TNF-α水平和外周血IL-1β、NF-κB、NLRP3 mRNA和信号通路蛋白表达水平均较NC组、阳性组和大黄蛰虫组明显偏高(均P<0.05)。结论 大黄蛰虫丸对动脉粥样硬化大鼠主动脉的炎性损伤可能具有明显的改善作用,可能是通过抑制IL-1β/NF-κB/NLRP3信号通路来实现治疗效果。

芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽大鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的影响

目的:探讨芩百清肺浓缩丸(芩百)对感染后咳嗽(PIC)大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1/白细胞介素1β(NLRP3/Caspase-1/IL-1β)信号通路的调节作用。方法:40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(阿斯美)及芩百清肺浓缩丸(芩百)组,每组10只。采用烟熏联合LPS滴鼻法及辣椒素雾化吸入法构建PIC模型。于造模后第18天开始灌胃给药,芩百组给予芩百清肺浓缩丸水溶液1.65 g/kg,阳性对照组给予阿斯美25.11 mg/kg,每日1次,连续给药10 d。末次干预后,ELISA检测BALF中IL-1β含量,、Western blot检测肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达。结果:与正常组相比,模型组BALF中IL-1β含量以及肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达均显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和芩百组上述指标均显著降低(P<0.05);芩百组BALF中IL-1β水平和肺组织NLRP3蛋白表达均显著低于阳性对照组(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸能够显著减轻PIC大鼠的气道炎症和气道高反应性,其作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关。

金茵清热口服液通过NF-κB/NLRP3信号通路改善小鼠急性肺损伤

目的探究金茵清热口服液对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤的保护作用及机制。方法C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为6组:空白对照组、模型对照组、金茵清热口服液小剂量组、金茵清热口服液中剂量组、金茵清热口服液大剂量组和地塞米松组。除空白对照组,其他各组气管滴注LPS溶液(5 mg·kg^(-1))构建小鼠急性肺损伤模型,金茵清热口服液低中高组连续灌胃给药3 d。24 h后,6组分别取小鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar larage fluid,BALF)进行后续检测,HE染色观察各组小鼠肺组织病理损伤;检测肺泡灌洗液总细胞数;BCA法检测BALF的总蛋白含量;ELISA法检测BALF中炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和免疫球蛋白M(IgM)的含量;免疫组化和Western blotting法检测肺组织核因子κB(NF-κB)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)蛋白的表达情况。结果与模型对照组比较,金茵清热口服液减轻了肺组织的病理学损伤(P<0.05),降低了肺泡灌洗液中总细胞数、总蛋白含量和IgM的表达(P<0.05),肺泡灌洗液中炎性细胞因子的TNF-α、IL-6和IL-1β的表达(P<0.01),肺组织NF-κB、NLRP3蛋白表达(P<0.05)。结论金茵清热口服液减轻了LPS诱导小鼠肺损伤的病理损伤,降低了炎性渗出和炎性细胞因子的表达,其作用机制可能是通过调控NF-κB/NLRP3信号通路,为其临床应用提供理论依据。

基于管周脂肪炎性微环境的黄芩汤调控NEK7-NLRP3/IL-1β保护肥胖高血压大鼠血管内皮功能研究

目的 探讨黄芩汤通过调控NEK7-NLRP3/IL-1β炎症轴改善肥胖高血压大鼠管周脂肪炎性微环境,保护血管内皮功能。方法 选取4周龄雄性Wistar大鼠50只,随机选取10只为对照组,另40只喂高盐高脂饲料构建肥胖高血压模型,造模成功的大鼠(20只)随机分为模型组,黄芩汤正常剂量组、高剂量组和IL-1β抑制剂组,每组5只。中药治疗组从第12周起,正常剂量组灌胃黄芩汤2.835 g·kg^(-1),高剂量组灌胃5.67 g·kg^(-1),IL-1β抑制剂组腹腔注射1.5 mg·kg^(-1) AS101,每周3次,干预8周。末次给药12 h后称质量并采血,分离胸主动脉及管周脂肪组织。检测血清炎症因子含量,观察病理变化,免疫荧光检测eNOS表达,Western blot和qPCR检测NEK7、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β的表达。结果 模型组大鼠体质量显著增加,管周脂肪脂滴面积增大,内皮损伤严重;模型组收缩压、舒张压,血清IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高,eNOS表达显著降低,NEK7、NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β蛋白及mRNA表达水平显著升高。与模型组相比,黄芩汤和IL-1β抑制剂组大鼠体质量降低,内皮损伤减轻,收缩压和舒张压降低,血清IL-1β、IL-6和TNF-α降低,eNOS表达升高。黄芩汤高剂量组和IL-1β抑制剂组NEK7、NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表达显著降低。另外,黄芩汤可保护肥胖高血压血管内皮功能,其中高剂量组效果较为明显。结论 黄芩汤能通过调节NEK7-NLRP3/IL-1β炎症轴,改善血管周围脂肪炎性微环境,保护肥胖高血压大鼠的血管内皮功能。

茯苓多糖通过SQLE/NLRP3/GSDMD信号通路调控肝癌细胞焦亡

目的:应用生物信息学分析技术初步探索肝细胞癌(HCC)脂代谢异常差异表达基因,并结合实验验证,探讨茯苓多糖通过角鲨烯环氧酶(SQLE)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/消皮素D(GSDMD)信号通路影响细胞焦亡的分子机制。方法:(1)利用GEO、GSEA、DAVID、STRING和GEPIA数据库筛选HCC脂代谢异常差异表达基因。(2)收集HCC患者肿瘤组织(n=9)验证SQLE基因的差异表达。(3)培养人HCC细胞系HepG2,采用CCK-8法筛选茯苓多糖浓度。(4)将HepG2细胞分为对照组和茯苓多糖(800 mg/L)组,划痕实验观察细胞迁移能力,RT-qPCR检测细胞中SQLE的mRNA表达水平。(5)进一步采用构建过表达SQLE(OE-SQLE)的HepG2细胞,再用茯苓多糖处理,分为5组:对照组、过表达阴性对照(OE-NC)组、OE-SQLE组、OE-NC+茯苓多糖组和OESQLE+茯苓多糖组。RT-qPCR和Western blot检测SQLE和焦亡相关因子的mRNA及蛋白表达水平;比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;ELISA法检测白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18释放水平;流式细胞术检测细胞坏死水平。结果:生物信息学分析筛选出差异表达基因SQLE。HCC患者肿瘤标本验证SQLE的mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。800 mg/L茯苓多糖干预48 h对HepG2细胞活力具有显著抑制作用,且可显著降低SQLE的mRNA表达水平(P<0.01)。SQLE过表达后,焦亡相关因子的mRNA和蛋白表达水平、细胞坏死水平,以及LDH、IL-1β和IL-18释放水平均显著降低(P<0.05);茯苓多糖干预后,上述指标均显著升高(P<0.05)。结论:SQLE在HCC中异常高表达;茯苓多糖可通过SQLE激活NLRP3/GSDMD焦亡通路,从而影响HCC细胞生长。

紫草素调节HIF-1α/NLRP3信号通路对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能损伤的影响

目的探究紫草素调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠神经功能损伤的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、YC-1(HIF-1α抑制剂,5 mg/kg)组、紫草素低剂量组(4 mg/kg)、紫草素高剂量组(25 mg/kg)、紫草素高剂量(25 mg/kg)+AG1(HIF-1α激活剂,10 mg/kg)组,每组15只。采用颈内动脉刺破法制备SAH模型。采用Zea-Longa评分法评估6组大鼠神经功能;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-1β水平;HE染色观察大鼠海马组织形态学变化,TUNEL染色法检测海马神经元凋亡率;伊文思蓝染色检测血脑屏障通透性;商品化试剂盒检测大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(MDA)、丙二醛(CAT)水平,Western blot检测大鼠脑组织Bax、Bcl-2、HIF-1α、NLRP3蛋白表达。结果假手术组大鼠海马神经元形态结构正常;与假手术组相比,模型组大鼠海马神经元有大量水肿、结构模糊,有细胞核溶解,变型固缩,部分细胞核消失,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著增加,脑组织SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,紫草素低剂量组、紫草素高剂量组和YC-1组鼠海马神经元病理损伤显著改善,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著降低,SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05);与紫草素高剂量组比较,紫草素高剂量+AG1组大鼠海马神经元病理损伤显著加重,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著增加,SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论紫草素抑制HIF-1α/NLRP3信号通路以降低氧化应激和炎性反应,进而改善SAH大鼠神经功能损伤。

风咳汤通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路减轻咳嗽变异性哮喘大鼠气道炎症

目的探讨风咳汤对咳嗽变异性哮喘(CVA)大鼠气道炎症及肺功能的改善作用及机制。方法采用卵蛋白(OVA)和氢氧化铝混合物1 mL皮下注射致敏后再以雾化的OVA激发哮喘建立CVA大鼠模型,分别给予风咳汤低剂量、高剂量和地塞米松进行治疗,正常对照组与模型组灌胃相应体积生理盐水。Diff-Quick法进行肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞计数,ELISA法检测各组大鼠BALF上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-22(IL-22)含量;观察大鼠肺组织病理学变化;检测大鼠肺组织中SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路中的相关蛋白和基因表达水平;检测肝组织中Caspase-1的活性。结果与正常组比较,模型组大鼠炎症细胞数量、炎症因子含量和HE染色显示的病理改变都显著升高,SIRT1表达水平下降,NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平和mRNA水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,风咳汤高剂量可以显著降低炎症细胞数和炎症因子含量,改善肺组织的病理改变,升高SIRT1的表达水平同时降低NF-κB、NLRP3、ASC和IL-1β的蛋白水平及mRNA水平,其作用与地塞米松相当。此外,风咳汤还可以降低Caspase-1的活性。结论风咳汤可以通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路有效改善CVA大鼠气道炎症,改善肺功能。

从“肝与大肠相通”理论探讨NLRP3信号通路与急性肝衰竭肠道微生态的相关性

急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指短时间内发生的肝功能急剧受损而无法维持正常生理功能的一种危重疾病,其预后不良甚至死亡。肠道作为人体内最大的免疫器官之一对免疫系统具有重要调节作用,可作为治疗疾病及其并发症的突破口;良好的肠道功能对人体健康是十分有利的,通过正确的干预手段去保护肠道黏膜屏障、调节肠道菌群、清除肠道毒素、纠正免疫炎症紊乱等促进肠道微生物稳态是保障肠道功能的重要环节。肠道黏膜屏障-通透性改变、肠道菌群产物、免疫因子失调等导致的免疫炎症反应与ALF密切相关;NLRP3信号通路是炎症反应和免疫调节中的重要通路,在ALF的肝细胞焦亡、氧化应激、肝细胞纤维化及肠道微生态相关作用中扮演着重要角色。该文以中医“肝与大肠相通”理论为切入点,探讨NLRP3信号通路与急性肝衰竭肠道微生态的相关性及主要机制,为ALF的防治提供思路和参考。

亮蓝G通过抑制P2X7/NLRP3通路减轻脑缺血再灌注大鼠神经炎症

目的:研究嘌呤受体P2X7在脑缺血再灌注损伤(CIRI)中的作用。方法:使用右侧大脑中动脉闭塞法(MCAO)制备大鼠CIRI模型,通过腹腔注射给予P2X7抑制剂亮蓝G(BBG)或NLRP3抑制剂MCC950处理。神经功能评分检测大鼠神经功能的改变,伊文思蓝染色检测血脑屏障完整性,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠脑脊液中IL-1β和IL-18的含量,通过Western Blot检测右侧大脑皮质中P2X7、CD11b和NLRP3的表达。结果:BBG或者MCC950处理能改善CIRI大鼠神经功能,同时降低脑组织中伊文思蓝的含量,并降低脑脊液中IL-1β和IL-18的水平。此外,BBG可以降低右侧大脑皮质中CD11b和NLRP3的表达,但是MCC950只能降低CD11b表达,对P2X7表达没有明显影响。结论:BBG通过抑制P2X7/NLRP3通路减轻CIRI大鼠神经炎症。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨针灸预防应激性胃溃疡细胞焦亡的作用机制

目的:观察针刺与艾灸对应激性胃溃疡模型大鼠的防治作用及其对模型大鼠胃黏膜NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路的干预作用,探索其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、预灸组和预针刺组。预灸组和预针刺组大鼠分别予艾灸、针刺中脘、足三里,每穴刺激20 min,连续7 d;正常组、模型组大鼠仅予艾灸支架固定。除正常组外,其余各组大鼠采用无水乙醇与阿司匹林混悬液灌胃制备应激性胃溃疡模型。造模结束后次日,各组大鼠麻醉后取血分离血清,取胃黏膜组织。评估胃黏膜损伤指数(UI),苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜组织的病理形态变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-18水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达。结果:模型组大鼠UI值明显高于正常组(P<0.01),胃黏膜组织明显损伤,存在出血灶,病理显示大量红细胞渗出;预灸组和预针刺组大鼠UI值均明显低于模型组(P<0.01),其中预灸组UI值明显低于预针刺组(P<0.05);预灸组和预针刺组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,病理显示胃黏膜大体完整,有少量红细胞渗出,其中预灸组胃黏膜病变程度更轻。模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明显高于正常组(P<0.01);预灸组和预针刺组上述指标水平均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中预灸组上述指标水平均明显低于预针刺组(P<0.05,P<0.01)。模型组大鼠胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05);预灸组和预针刺组上述蛋白表达水平均明显低于模型组(P<0.05),其中预灸组Caspase-1蛋白表达水平明显低于预针刺组(P<0.05)。结论:针刺与艾灸均可以预防应激性胃溃疡胃黏膜损伤,其可能通过调控胃黏膜组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路蛋白表达水平,缓解胃黏膜炎症反应,其中艾灸预处理对炎症因子的改善更具优势。

基于NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路探讨双硫仑改善HFpEF大鼠心功能的机制

目的:探讨双硫仑(DSF)在高脂饮食(HFD)和一氧化氮阻滞剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME诱导的射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)大鼠模型中的作用及可能的机制。方法:通过HFD+L-NAME构建HFpEF大鼠模型;将SD大鼠随机分为三组:control组(给予正常饮食和水喂养)、HFpEF组(给予HFD和含0.5 g/L L-NAME的饮用水喂养)和DSF+HFpEF组(在HFD+L-NAME的基础上给予DSF治疗)。5周后,使用超声心动图和运动力竭实验检测心功能;苏木素-伊红和麦胚凝集素染色检测心肌病理改变;Masson染色检测心肌纤维化程度;TUNEL染色观察细胞凋亡水平;Western blot检测心肌中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、cleaved caspase-1和消皮素D的N端片段(GSDMD-N)蛋白水平;ELISA检测血清N末端脑利尿钠肽前体(NT-proBNP)水平及心肌中白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18含量。结果:与control组相比,HFpEF组大鼠体重、收缩压、舒张压、E/E'比值、舒张期左心室前壁厚度(LVAWd)和血清NT-proBNP水平均显著升高(P<0.05),E/A比值和整体纵向应变(GLS)绝对值均显著降低(P<0.05);与HFpEF组相比,DSF+HFpEF组大鼠体重、E/E'比值、舒张压和血清NTproBNP水平均显著降低(P<0.05),E/A比值和GLS绝对值显著升高(P<0.05),收缩压、舒张期左心室后壁厚度(LVPWd)和左心室射血分数(LVEF)无显著改变(P>0.05)。与control组相比,HFpEF组大鼠心肌纤维化面积、心肌细胞横截面积和凋亡率均显著升高(P<0.05),DSF+HFpEF组大鼠上述指标均显著下降(P<0.05)。Western blot和ELISA结果显示,与control组相比,HFpEF组大鼠心肌中NLRP3、cleaved caspase-1和GSDMD-N蛋白水平及炎症因子IL-1β和IL-18含量均显著升高(P<0.05);与HFpEF组相比,DSF+HFpEF组大鼠上述指标均显著下降(P<0.05)。结论:DSF可改善HFpEF大鼠心功能,抑制心肌重构,其机制可能与抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路、减轻心肌炎症反应有关。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响。方法大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、依那普利(10 mg/kg)组和柴胡皂苷B2低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),每组12只。除假手术组外,其余5组建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,各组灌胃给予相应药物,每天1次,连续给药2周。全自动生化分析仪检测大鼠血清中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β水平,Masson染色观察大鼠肾组织病理学变化,试剂盒检测大鼠肾组织中肾上腺髓质素(ADM)水平,免疫组化法检测大鼠肾组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)阳性表达,Western blot法检测大鼠肾组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠肾组织可见肾小管扩张,上皮细胞出现部分空泡化,肾间质内大量炎性细胞浸润、纤维细胞生成及胶原纤维沉积,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平、肾组织TGF-β1阳性表达、TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达升高(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达降低(P<0.05);与模型组比较,柴胡皂苷B2各剂量组大鼠肾脏病变逐渐减轻,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平,肾组织TGF-β1阳性表达,TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达均升高(P<0.05);与柴胡皂苷B2高剂量组比较,依那普利组上述指标无明显变化(P>0.05)。结论柴胡皂苷B2能够缓解UUO大鼠肾间质纤维化,改善肾功能和炎症反应,可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的表达有关。

益母草碱调节IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路对急性呼吸窘迫综合征大鼠炎症反应的影响

目的探究益母草碱调节IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠炎症反应的影响。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、益母草碱低剂量组、益母草碱高剂量组、联用HY-N2485组(高剂量益母草碱+NLRP3激活剂)。检测大鼠肺功能;血气分析仪检测氧分压(PaO_(2))和二氧化碳分压(PaCO_(2));ELISA法检测肺泡灌洗液白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;检测肺组织干湿比;检测肺组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性;HE染色观察大鼠肺组织病理形态;Western blotting检测肺组织中IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果与空白组相比,模型组肺组织形态有明显损伤,PEF、FVC和FEV0.3/FVC水平、PaO_(2)、OI水平、肺泡灌洗液IL-10水平、肺组织CAT和SOD活性降低,PaCO_(2)水平、肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平、肺组织病理评分、肺组织MDA含量、IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,益母草碱低、高剂量组大鼠肺组织损伤明显减轻,PEF、FVC和FEV0.3/FVC水平、PaO_(2)、OI水平、肺泡灌洗液IL-10水平、肺组织CAT和SOD活性升高,PaCO_(2)水平、肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平、肺组织病理学评分、肺组织MDA含量、IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05);HY-N2485可减弱益母草碱对ARDS大鼠的改善作用(P<0.05)。结论益母草碱可降低ARDS大鼠炎症和氧化应激,减轻肺组织损伤,改善肺功能,可能与抑制IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路有关。