NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究

目的构建大鼠NELL2基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NELL2的microRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应。方法从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的片段克隆至表达载体pcDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2。针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4)。将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组),采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染pcDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组。结果酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确。Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P<0.05或P<0.01)。结论成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒,证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应。

不同性发育期雌性大鼠下丘脑组织NELL2和GnRH mRNA表达研究

目的研究不同性发育期雌鼠下丘脑组织中NELL2和GnRH mRNA表达的变化。方法SD雌鼠按日龄分为幼年组(20日龄)、青春期前组(30日龄)、青春早期组(35日龄)和性发育成熟期组(45日龄),每组10只。Real-time PCR检测各组雌鼠下丘脑组织NELL2、GnRH mRNA表达,并进行组间比较和分析。结果在幼年组、青春期前组、青春早期组和性发育成熟期组雌鼠的下丘脑组织中,NELL2 mRNA相对表达分别为-1.01±0.09、-0.78±0.16、-1.09±0.10和-1.14±0.12;GnRH mRNA相对表达分别为-2.92±0.15、-2.44±0.10、-1.66±0.13和-2.13±0.19。统计学分析表明,NELL2 mRNA表达为青春期前组>幼年组>青春早期组>性发育成熟期组,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);GnRH mRNA表达为青春早期组>性发育成熟期组>青春期前组>幼年组,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论不同性发育期雌鼠下丘脑组织中NELL2和GnRH mRNA表达水平明显不同;与GnRH mRNA比较,NELL2 mRNA表达高峰出现较早。提示在青春期前,NELL2可能通过上调GnRH神经元GnRH mRNA表达而参与性发育启动。

NELL2a在斑马鱼神经丘的表达及其突变模型构建

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NELL2a基因突变模型,为探究NELL2a在非综合型听神经病谱系障碍(auditory neuropathy spectrum disorder,ANSD)发生发展中的作用奠定基础。方法通过原位杂交技术,证实NELL2a基因在侧线神经丘表达,针对斑马鱼NELL2a基因,设计gRNA靶位点,体外合成gRNA和Cas9 RNA,在胚胎发育的单细胞期,通过显微注射的方法,将其注射入胚胎内。待仔鱼发育至一定时期,通过尾鳍鉴定,进而获得NELL2a F0代,后续通过F0代侧交,获得F1代杂合子,通过F1代自交获得F2代纯合子。通过听觉诱发电位(AEP)检测F2代纯合子的听力状态。结果通过测序证明已经获得NELL2a(ΔGC)纯合子,Nell2a^-/-斑马鱼在600、800、1000和2000 Hz声刺激频率的AEP阈值均显著高于野生型斑马鱼。结论NELL2a表达于斑马鱼侧线神经丘,推测其对神经丘毛细胞的功能起着重要作用,具体机制有待进一步研究。

NELL2及其在促性腺激素释放激素分泌中的作用

机体的青春发育及生殖过程受下丘脑一垂体一性腺轴的调控。下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）神经元活化导致GnRH分泌增多是青春期启动的触发因素。GnRH神经元功能活动的调节机制非常复杂，有多种因子影响GnRH的分泌。谷氨酸作为最主要的兴奋性神经递质，可以通过多种机制促进GnRH的分泌。近年来有研究发现NELL2可能通过调节谷氨酸的分泌或其他机制影响GnRH的分泌，进而影响青春期启动。NELL2在神经生长、神经分化和维护神经可塑性以及突触运输等过程中发挥重要作用。

基于NELL2 Lumicrine信号通路探索引阳索胶囊对肾阳虚型精子损伤的保护作用及机制

目的研究引阳索胶囊对腺嘌呤诱导的肾阳虚大鼠精子损伤的保护作用,并从睾丸神经表皮样生长因子2(neural EGFL like 2,NELL2)Lumicrine信号通路探索其作用机制。方法雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、引阳索(432 mg/kg)组和左卡尼汀(100 mg/kg)组,每组10只。连续ig腺嘌呤(200 mg/kg)14 d建立大鼠肾阳虚模型,并通过观察大鼠肾阳虚证候表现、眼眶取血检测血清中睾酮水平判断造模是否成功;造模同时给予药物干预49 d后取材,计算睾丸、附睾脏脑系数;计算机辅助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)检测附睾精子动力学参数;光镜下进行精子计数、精子畸形率检测;精子荧光检测精子活率;苏木素-伊红(HE)染色观察睾丸、附睾组织病理变化;ELISA法检测血清中睾酮水平;免疫荧光法观察睾丸NELL2分泌及附睾c-ros癌基因1(ROS proto-oncogene 1,ROS1)表达;Western blotting检测附睾蛋白酶卵磷脂酶2(ovochymase 2,OVCH2)和精子去整合素金属蛋白酶3(a disintegrin and metalloproteinase 3,ADAM3)表达。结果与模型组比较,引阳索胶囊可改善肾阳虚大鼠毛发粗糙脱落、精神不振、蜷缩拱背、尿量增多、体质量降低等肾阳虚证候表现,升高睾丸、附睾脏脑系数(P<0.01);显著提高精子数量、精子活率、各精子动力学参数(P<0.05、0.01、0.001),降低精子畸形率,降低曲细精管病变率(P<0.001),升高14、49 d血清中睾酮水平(P<0.01、0.001);显著升高睾丸NELL2及附睾ROS1、OVCH2、ADAM3蛋白表达水平(P<0.05、0.01、0.001)。结论引阳索胶囊对腺嘌呤诱导的肾阳虚大鼠精子损伤具有保护作用,其机制可能与其调节NELL2 Lumicrine信号通路参与精子发生成熟过程有关。