高内涵筛选NF-κB信号通路的技术体系建立

NF-κB是参与免疫调节、炎症反应、肿瘤发生等过程重要的转录因子,在TNFα、IL-1β、LPS等因子诱导下NF-κB发生核转位并激活其转录活性。尝试利用高内涵筛选(High Content Screening,HCS)和RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术建立NF-κB核转位高通量筛选体系,该体系的应用将有助于发现新的NF-κB信号通路调节因子,为免疫与肿瘤的机制研究提供线索。

RNAi的抑制物及其应用

在植物、动物中广泛存在的一种基因调控现象,RNAi现象是通过调控RNA的分子水平来抑制基因表达。被认为是一种抑制病毒性复制和转座子活动的抗御机制。在此过程中,侵染型病毒为了能够不被这种机制干扰抑制,继续在寄主体内生存、繁殖,则产生了一种反抗御机制———即产生抑制蛋白来对抗转录后基因沉默。本文集中讨论了当前已知的植物病毒编码的沉默抑制物。它们在抑制途径中的不同阶段干扰沉默,这些抑制物已成为一种有力的工具来帮助了解植物中RNA沉默的机制,并在研究基因功能等方面有着广泛的应用前景。

沉默供体肝脏内核糖体蛋白S3基因减轻大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤

目的采用RNA干扰技术沉默供体肝脏内核糖体蛋白S3(ribosomal protein S3,RPS3)基因的表达,观察其对核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的影响以及对肝移植后早期缺血再灌注损伤的保护作用。方法构建以腺病毒(Ad)为载体的RPS3基因特异性短发夹RNA(shRNA)表达颗粒,按随机数字表法将实验大鼠分为3组:Ad-RPS3-shRNA组、空白腺病毒对照组(空白对照组)、生理盐水对照组(NS对照组)。于肝移植前48 h分别用Ad-RPS3-shRNA颗粒、空白腺病毒载体、生理盐水处理3组供体大鼠。收集血液及肝脏组织检测血清转氨酶、血浆炎症因子水平、肝脏组织病理改变、炎症因子mRNA、肝组织提取物中NF-κB活性和表达水平指标的变化。结果肝移植后恢复灌注3 h Ad-RPS3-shRNA组大鼠血清ALT水平(725.9±67.3)U/L、AST水平(863.7±72.7)U/L,血浆TNF-α水平(223.7±16.8)ng/L、IL-1β水平(242.5±18.7)ng/L、ICAM-1水平(258.4±24.9)ng/L,Suzuki评分(3.72±0.31),肝组织mRNA水平:TNF-α(0.252±0.026)、IL-1β(0.217±0.028)、ICAM-1(0.226±0.017)、RPS3(0.094±0.007),肝组织NF-κB蛋白水平(0.216±0.022)及其活性(92.4±9.5)均显著低于空白对照组和NS对照组(P<0.01),而空白对照组、NS对照组比较无统计学差异(P>0.05);恢复灌注12 h Ad-RPS3-shRNA组各检测指标与3 h变化趋势相同。结论沉默供体肝脏内RPS3基因可显著降低肝脏细胞NF-κB活性和表达量,从而降低炎症因子表达,有效减轻肝移植后早期缺血再灌注损伤。