清热祛浊胶囊对非酒精性脂肪肝炎小鼠NF-κB/NLRP3信号通路的调控机制研究

[目的]研究清热祛浊胶囊(QRQZ)对非酒精性脂肪肝炎(NASH)模型小鼠的治疗效果及对核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的影响。[方法]通过蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食诱导建立NASH小鼠模型,并灌胃不同剂量的QRQZ。通过检测各组小鼠体质量、肝指数、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC),肝苏木素-伊红(HE)染色及油红O染色评估QRQZ对NASH模型小鼠的治疗作用;通过检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)水平评估QRQZ对NASH模型小鼠氧化应激水平;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平评估QRQZ对NASH模型小鼠炎症的影响;通过检测磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκB)、磷酸化核转录因子κB P65(p-NF-κB P65)、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cleaved Caspase-1)、mature IL-1β的蛋白水平以及NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表达来评估QRQZ对NASH小鼠NF-κB/NLRP3信号通路的影响。[结果] QRQZ可改善MCD引起的体质量减轻,降低肝指数,降低血清ALT、AST活性及TC、TG水平,同时改善肝组织病理学变化,提示QRQZ对NASH模型小鼠具有治疗作用;此外,QRQZ提升肝组织中SOD、GSH-Px活性,降低了MDA水平,降低了IL-6、IL-1β、iuTNF-α炎症因子水平,提示了QRQZ的抗氧化及抗炎作用;进一步研究发现QRQZ降低了IκB与P65的磷酸化水平,减少NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白及基因表达。提示QRQZ干预抑制了NASH小鼠NF-κB/NLRP3信号通路活化。[结论] QRQZ对NASH模型小鼠具有治疗作用,并且可以提升抗氧化能力改善炎症,其作用机制可能与抑制NF-κB/NLRP3信号通路活化有关。

α-倒捻子素通过NF-κB途径抑制LPS/ATP诱导的小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活

目的探究α-倒捻子素(α-mangostin)在脊髓损伤后小胶质细胞炎症模型中作用及相关机制。方法体外培养小鼠小胶质细胞系BV-2细胞,利用脂多糖和三磷酸腺苷(LPS/ATP)联合诱导的方式建立BV-2炎症模型。CCK-8法检测不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)的α-mangostin对LPS/ATP刺激下的细胞增殖活力影响以筛选适宜的α-mangostin浓度范围;将BV-2细胞分为Ctrl组、LPS/ATP组、40μmol/Lα-mangostin组和不同浓度(10、20、40μmol/L)的α-mangostin干预组(分别记为LPS/ATP+10μmol/Lα-mangostin组、LPS/ATP+20μmol/Lα-mangostin组与LPS/ATP+40μmol/Lα-mangostin组)。ELISA实验检测各组BV-2细胞上清液中促炎因子白介素-6/1β/18(IL-6、IL-1β、IL-18)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量,Western blot检测各组细胞中NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、裂解型半胱氨酸蛋白酶1(cleaved caspase-1)和白介素1β(IL-1β)表达及核因子κB(NF-κB)途径中p65的磷酸化水平(p-p65/p65)和BV-2细胞核中p65的表达。结果与Ctrl组相比,LPS/ATP组细胞增殖活力明显降低(P<0.05),但低浓度(10、20、40μmol/L)的α-mangostin可显著改善LPS/ATP对小胶质细胞增殖活力的抑制作用(P<0.05),但高浓度(80μmol/L)α-mangostin可促进LPS/ATP对小胶质细胞的损伤(P<0.05)。与Ctrl组相比,40μmol/Lα-mangostin组小胶质细胞上清液中炎症因子IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α含量和细胞中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和p-p65/p65比值及细胞核中p65蛋白均无明显改变(P>0.05),而LPS/ATP组均显著增加(P<0.05);与LPS/ATP组相比,不同浓度α-mangostin干预组中IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α含量和BV-2细胞中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和p-p65/p65比值及细胞核中p65蛋白表达随α-mangostin浓度的增加而依次降低,其中以LPS/ATP+40μmol/Lα-mangostin组的降低程度最为明显(P<0.01)。结论α-mangostin可通过NF-κB途径抑制BV-2细胞中NLRP3炎性小体活化所介导的神经炎症反应。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉性心脏病小鼠心肌保护作用

目的 研究基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)小鼠心肌保护作用。方法 50只6周的雄性SD小鼠中取10只作正常对照组,其余小鼠给予高脂饮食建立CHD模型。采用随机数字表法将40只模型小鼠分为模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组,每组各10只。黄连解毒汤低、中、高剂量组每日分别以10、20、40 g/kg剂量进行灌胃,每日1次,持续6周;正常组、模型组每日给予等量蒸馏水灌胃。干预后采用生化法检测各组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平,酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、内皮素水平;采用苏木精-伊红染色法观察小鼠心肌细胞病理形态,蛋白质印迹法检测心肌组织中TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。比较各组小鼠血脂、心肌组织中抗氧化相关指标和TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。结果 模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组血脂水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低剂量组与模型组血脂水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);黄连解毒汤中、高剂量组总胆固醇、甘油三酯、LDL水平均低于模型组,HDL水平高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组心肌组织中SOD水平均低于对照组,丙二醛、内皮素水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组SOD水平均高于模型组,丙二醛、内皮素水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组心肌纤维排列整齐,横纹清晰且细胞完整,无细胞肿胀、炎症浸润等;模型组心肌纤维排列紊乱,结构发生异常,有严重细胞肿胀、炎症浸润;黄连解毒汤低、中、高剂量组未见心肌纤维断裂,黄连解毒汤中、高剂量组细胞肿胀和炎症浸润情况优于黄连解毒汤低剂量组,黄连解毒汤高剂量组优于黄连解毒汤中剂量组。模型组、黄连解毒汤中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。且黄连解毒汤各剂量组中以上指标变化呈剂量依赖性。结论 黄连解毒汤能降低CHD小鼠血脂水平,保护心肌细胞,其能够通过下调组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达以调节血脂水平并改善心肌功能,且黄连解毒汤的效果随着剂量的增加而增强。

三叶青黄酮通过TLR4/NF-κB通路调控NLRP3小体激活改善大鼠心肌细胞缺氧再复氧损伤的作用及机制

目的探究三叶青黄酮(RTHF)对大鼠心肌细胞缺氧再复氧(H/R)损伤的作用及其可能机制。方法以大鼠心肌细胞H9C2为研究对象,分为对照组、H/R组、H/R+低浓度RTHF(L-RTHF)组(25μg/mL)、H/R+中浓度RTHF(M-RTHF)组(50μg/mL)和H/R+高浓度RTHF(H-RTHF)组(100μg/mL)。通过CCK-8法检测各组细胞活力;试剂盒检测各组细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、消皮素D的N端切割产物(GSDMD-N)、Toll样受体4(TLR4)、磷酸化核因子κB p65(p-NF-κB p65)、核因子κB p65(NF-κB p65)的表达水平。结果与对照组比较,H/R组H9C2细胞活力[(71.33±1.70)%比(100.00±2.94)%,P<0.01]、SOD水平[(15.54±0.36)U/mg prot比(34.54±0.87)U/mg prot,P<0.01]降低,ROS相对DCF强度[(3.72±0.12)比(1.00±0.10),P<0.01]和LDH水平[(387.57±9.37)U/L比(182.80±11.53)U/L,P<0.01]升高,NLRP3[(2.75±0.04)比(1.00±0.02)、(4.71±0.18)比(1.00±0.11),P<0.01]、Caspase-1[(3.02±0.11)比(1.00±0.06)、(3.33±0.09)比(1.00±0.12),P<0.01]、ASC[(3.32±0.12)比(1.00±0.09)、(5.30±0.15)比(1.00±0.10),P<0.01]、GSDMD-N[(3.69±0.14)比(1.00±0.13)、(3.23±0.08)比(1.00±0.06),P<0.01]、TLR4[(4.00±0.12)比(1.00±0.09)、(5.68±0.20)比(1.00±0.10),P<0.01]、p-NF-κB p65[(6.81±0.16)比(1.00±0.10)、(3.25±0.07)比(1.00±0.05),P<0.01]相对mRNA和蛋白水平升高;与H/R组比较,H/R+M-RTHF组和H/R+H-RTHF组的细胞活力[(77.00±2.16)%、(82.00±2.16)%比(71.33±1.70)%,P<0.05或P<0.01]、SOD水平[(23.43±1.50)U/mg prot、(28.66±1.22)U/mg prot比(15.54±0.36)U/mg prot,P<0.05或P<0.01]升高,ROS[(3.24±0.05)、(2.57±0.04)比(3.72±0.12),P<0.05或P<0.01]、LDH[(332.77±5.76)U/L、(253.36±9.43)U/L比(387.57±9.37)U/L,P<0.05或P<0.01]水平降低,NLRP3[(1.86±0.06)、(1.56±0.09)比(2.75±0.04),(2.97±0.11)、(1.86±0.06)比(4.71±0.18),P<0.05或P<0.01]、Caspase-1[(2.06±0.13)、(1.27±0.06)比(3.02±0.11),(2.12±0.15)、(1.42±0.09)比(3.33±0.09),P<0.05或P<0.01]、ASC[(2.40±0.25)、(2.19±0.14)比(3.32±0.12),(2.46±0.08)、(1.28±0.05)比(5.30±0.15),P<0.05或P<0.01]、GSDMD-N[(2.43±0.07)、(2.19±0.13)比(3.69±0.14),(1.91±0.07)、(1.46±0.07)比(3.23±0.08),P<0.05或P<0.01]、TLR4[(3.52±0.09)、(1.88±0.11)比(4.00±0.12),(4.04±0.32)、(2.07±0.07)比(5.68±0.20),P<0.05或P<0.01]、p-NF-κB p65[(4.09±0.12)、(3.03±0.20)比(6.81±0.16),(1.93±0.31)、(1.39±0.12)比(3.25±0.07),P<0.05或P<0.01]相对mRNA和蛋白水平降低,且这种变化呈现RTHF剂量依赖性。结论在H/R诱导的大鼠心肌细胞中,RTHF可能通过抑制ROS和TLR4/NF-κB通路调控NLRP3小体激活,进而抑制细胞焦亡。

STING高表达通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3通路和影响炎症

目的探讨STING在肾缺血再灌注损伤(IRI)中的表达水平以及相关作用机制。方法在体内水平,将24只C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham)、IRI组、IRI+药物溶剂组(IRI+DMSO)、IRI+SN-011组,6只/组。通过肾动脉夹闭方法建立IRI模型,通过血清肌酐和尿素氮检测、PAS染色检测肾组织损伤变化,采用RT-qPCR、ELISA、Western blotting和IHC法检测肾组织中STING、KIM-1、Bcl-2、Bax、caspase-3、TLR4、P65、NLRP3、caspase-1、CD68、MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。在体外水平,将HK-2细胞分为对照组、缺氧复氧(H/R)组、H/R+药物溶剂组(H/R+DMSO)、H/R+SN-011组,用厌氧包模拟缺氧环境,RT-qPCR和Western blotting法检测STING表达水平,流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果在体内水平,与Sham组相比,IRI组的PAS染色显示组织损伤增加(P<0.05),小鼠血清肌酐、尿素氮含量以及组织KIM-1、STING、TLR4、P65、NLRP3、caspase-1、caspase-3、Bax、CD68、MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平升高(P<0.05),Bcl-2水平降低(P<0.05),SN-011抑制STING表达后,逆转了上述结果(P<0.05)。在体外水平,与对照组相比,H/R组STING的mRNA与蛋白水平升高(P<0.05),流式细胞仪检测显示细胞凋亡率上升(P<0.05),SN-011抑制STING表达,细胞凋亡率下降(P<0.05)。结论STING在肾脏IRI中表达水平上升,且可通过作用于TLR4/NF-κB/NLRP3通路以及影响炎症与凋亡水平促进肾损伤。

金茵清热口服液通过NF-κB/NLRP3信号通路改善小鼠急性肺损伤

目的探究金茵清热口服液对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤的保护作用及机制。方法C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为6组:空白对照组、模型对照组、金茵清热口服液小剂量组、金茵清热口服液中剂量组、金茵清热口服液大剂量组和地塞米松组。除空白对照组,其他各组气管滴注LPS溶液(5 mg·kg^(-1))构建小鼠急性肺损伤模型,金茵清热口服液低中高组连续灌胃给药3 d。24 h后,6组分别取小鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar larage fluid,BALF)进行后续检测,HE染色观察各组小鼠肺组织病理损伤;检测肺泡灌洗液总细胞数;BCA法检测BALF的总蛋白含量;ELISA法检测BALF中炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和免疫球蛋白M(IgM)的含量;免疫组化和Western blotting法检测肺组织核因子κB(NF-κB)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)蛋白的表达情况。结果与模型对照组比较,金茵清热口服液减轻了肺组织的病理学损伤(P<0.05),降低了肺泡灌洗液中总细胞数、总蛋白含量和IgM的表达(P<0.05),肺泡灌洗液中炎性细胞因子的TNF-α、IL-6和IL-1β的表达(P<0.01),肺组织NF-κB、NLRP3蛋白表达(P<0.05)。结论金茵清热口服液减轻了LPS诱导小鼠肺损伤的病理损伤,降低了炎性渗出和炎性细胞因子的表达,其作用机制可能是通过调控NF-κB/NLRP3信号通路,为其临床应用提供理论依据。

苦豆碱通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路改善香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤

目的探究苦豆碱(Alo)对香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤的作用及其可能的作用机制。方法16HBE人支气管上皮细胞经100 mL/L香烟烟雾提取物(CSE)和(50、100、200)μmol/L Alo共处理后,CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、Western blot法检测细胞凋亡,ELISA检测炎性因子水平;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针和相关试剂盒检测氧化应激水平;Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)通路相关蛋白表达水平。16HBE细胞经100 mL/L CSE和200μmol/L Alo共处理后,采用上述方法检测过表达TLR4对TLR4/NF-κB/NLRP3通路、细胞LDH活性、凋亡、炎症反应及氧化应激的影响。结果CSE暴露可降低16HBE细胞活力,增加LDH释放和细胞凋亡,增强炎症反应和氧化应激水平,且激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路;经Alo处理后,细胞活性升高,LDH释放减少、凋亡降低、炎症减轻、氧化应激水平下降,且TLR4/NF-κB/NLRP3通路失活;TLR4过表达可逆转Alo处理对CSE诱导的16HBE细胞损伤的保护作用。结论Alo可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路减轻CSE诱导的人支气管上皮细胞损伤。

二甲双胍通过抑制NF-κB/NLRP3通路改善草酸钙诱导人肾小管上皮细胞损伤研究

目的研究二甲双胍(metformin,Met)通过抑制NF-κBNLRP3通路改善草酸钙(Calcium Oxalate,CaOx)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤。方法分别随机将人肾小管上皮细胞分成对照组、实验组(CaOx+HK-2)、高浓度Met组(CaOx+HK-2+1.2 mM Met)、低浓度Met组(CaOx+HK-2+0.80 mM Met)、通路干预组(CaOx+HK-2+PDTC)五组。各组细胞培养24 h,采用酶联免疫吸附测定(Elisa)法检测细胞上清液中炎症因子(IL-6、IL-18、IL-1β),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞中NF-κB、NLRP3、骨桥蛋白(OPN)mRNA。结果各组间细胞上清液IL-6、IL-18、IL-1β含量相比差异均有统计学意义(P均<0.05);各组间细胞中NF-κBmRNA表达量、NLRP3mRNA表达量、OPNmRNA表达量相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论1.20 mmol/L或0.80 mmol/L Met可以通过抑制NF-κB/NLRP3通路调控下游的炎症相关蛋白及黏附蛋白表达,继而改善CaOx诱导人肾小管上皮细胞损伤及减少草酸钙肾结石形成。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响。方法大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、依那普利(10 mg/kg)组和柴胡皂苷B2低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),每组12只。除假手术组外,其余5组建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,各组灌胃给予相应药物,每天1次,连续给药2周。全自动生化分析仪检测大鼠血清中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β水平,Masson染色观察大鼠肾组织病理学变化,试剂盒检测大鼠肾组织中肾上腺髓质素(ADM)水平,免疫组化法检测大鼠肾组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)阳性表达,Western blot法检测大鼠肾组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠肾组织可见肾小管扩张,上皮细胞出现部分空泡化,肾间质内大量炎性细胞浸润、纤维细胞生成及胶原纤维沉积,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平、肾组织TGF-β1阳性表达、TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达升高(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达降低(P<0.05);与模型组比较,柴胡皂苷B2各剂量组大鼠肾脏病变逐渐减轻,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平,肾组织TGF-β1阳性表达,TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达均升高(P<0.05);与柴胡皂苷B2高剂量组比较,依那普利组上述指标无明显变化(P>0.05)。结论柴胡皂苷B2能够缓解UUO大鼠肾间质纤维化,改善肾功能和炎症反应,可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的表达有关。

羟基积雪草苷通过抑制NF-κB/NLRP3细胞焦亡通路缓解间质性膀胱炎

目的 通过NF-κB/NLRP3介导的细胞焦亡途径探究羟基积雪草苷对间质性膀胱炎的相关作用。方法 通过脂多糖建立体外间质性膀胱炎细胞模型,使用不同浓度的羟基积雪草苷处理,采用MTT、单层细胞划痕伤口实验、实时荧光定量PCR和蛋白印迹实验检测羟基积雪草苷对SV-HUC-1细胞间质性膀胱炎体外模型中细胞活力,伤口愈合能力和NF-κB/NLRP3通路介导的细胞焦亡相关蛋白和mRNA的表达的作用。结果 体外细胞实验结果显示,与模型组相比,羟基积雪草苷能改善细胞活力和伤口愈合能力,并抑制细胞模型中NF-κB/NLRP3通路介导的细胞焦亡相关蛋白和mRNA的表达。结论 在脂多糖诱导的SV-HUC-1细胞间质性膀胱炎体外模型中,羟基积雪草苷可通过抑制NF-κB/NLRP3通路介导的细胞焦亡从而发挥对膀胱上皮细胞的保护作用。

积雪草酸通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路改善非酒精性脂肪肝的机制研究

探究天然活性成分积雪草酸(asiatic acid,AA)对高脂饮食导致的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的改善作用及机制。取雄性C57BL/6J小鼠40只,分为正常组、模型组、AA低剂量组、AA高剂量组,高脂饮食4周后给予AA干预,持续12周;实验结束后,称量肝脏重量并计算肝脏指数;通过分光光度法测定小鼠血清中脂肪肝相关生化指标的含量;通过酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测小鼠血清中相关炎症因子的表达水平;通过免疫印记法检测小鼠肝脏中TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的表达;通过多种染色法观察小鼠肝脏病理学变化。结果显示:AA可以有效改善NAFLD小鼠的一般指标,生化指标、炎症因子及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的表达。AA可以通过下调TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制肝脏炎症,改善NAFLD。

基于TLR4/NF-κB通路探究NLRP3对铜绿假单胞菌的清除机制

目的基于TLR4/NF-κB通路探究NLRP3对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的清除机制。方法采用PA感染的HP-1诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞,然后沉默巨噬细胞中NLRP3(si-NLRP3)和TLR4(si-TLR4),用ELISA检测上清液中IL-1β和IL-8的表达水平;RT-PCR检测细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA表达;蛋白质印迹检测细胞中TLR4、p-NF-κB P65蛋白表达。结果铜绿假单胞菌感染的THP-1诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞hMDMs上清液中IL-1β、IL-8水平、NLRP3、caspase-1 mRNA表达及TLR4、p-NF-κB P65蛋白表达明显增加(P<0.05)。和si-NC组相比,THP-1诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞hMDMs沉默NLRP3和TLR4后的si-NLRP3和si-TLR4组上清液中IL-1β、IL-8表达、NLRP3、caspase-1 mRNA表达及TLR4、p-NF-κB P65蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。和si-NC组相比,沉默PA感染的THP-1巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞hMDMs中NLRP3和TLR4表达细胞清除率明显增加(P<0.05)。结论沉默NLRP3可增加巨噬细胞对PA的清除作用,其作用机制可能和抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关。

茯苓多糖通过NF-κB和NLRP3信号通路调节脂多糖引起的焦虑和抑郁样行为

目的:探讨茯苓多糖(Poria cocos polysaccharide,PPS)对脂多糖(LPS)引起的焦虑和抑郁样行为的影响,并分析其机制。方法:BV-2细胞分成对照组、LPS组、LPS+氟西汀组、LPS+PPS(PPS分别为4、8、16μmol/L),处理24 h,二氯二氢荧光素二氢乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,Griess法检测培养上清液NO水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中TNF-α、IL-1β水平,Western blot实验检测CD206、CD16/32、NF-κB p65水平。动物实验将小鼠分为对照组、模型组、LPS+氟西汀组、LPS+PPS低剂量组(20 mg/kg)、LPS+PPS高剂量组(80 mg/kg),每组10只,测试抑郁样行为,检测海马组织TNF-α、IL-1β、IL-18的浓度,分析海马组织CD206、CD16/32、NF-κB p65、NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1蛋白水平。结果:与LPS组比较,4、8、16μmol/L PPS能极显著降低ROS荧光相对强度(P<0.01),下调NO、TNF-α、IL-1β水平,降低CD16/32、NF-κB p65水平,增加CD206水平(P<0.05);与模型组比较,LPS+PPS低剂量组、LPS+PPS高剂量组蔗糖偏爱率极显著增加(P<0.01),旷场穿越次数、修饰次数极显著上调(P<0.01),悬尾不动时间、强迫游泳不动时间极显著降低(P<0.01);与模型组比较,LPS+PPS低剂量组、LPS+PPS高剂量组IL-1β、IL-18、TNF-α水平极显著降低(P<0.01),CD16/32、NF-κB p65水平显著下调(P<0.05),CD206显著上调(P<0.05),NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1水平极显著降低(P<0.01)。结论:茯苓多糖能通过抑制NF-κB和NLRP3信号通路减轻LPS诱导的焦虑和抑郁样行为。

岩白菜素通过调控NF-κB/NLRP3通路和代谢对特发性肺间质纤维化小鼠的影响

目的探讨岩白菜素对特发性肺间质纤维化(IPF)小鼠的影响。方法采用博来霉素气管内滴注建立IPF小鼠模型,灌胃给予岩白菜素干预28 d,记录小鼠体质量变化和肺指数,HE染色观察肺组织病理变化,Masson染色观察肺组织胶原纤维变化,免疫荧光法观察肺组织α-SMA、NLRP3表达,RT-qPCR法检测肺组织p65、NLRP3、GSDMD、ASC mRNA表达,Western blot法检测肺组织p65、IκBα、NLRP3蛋白表达。结果与模型组比较,岩白菜素组小鼠肺组织中α-SMA表达,p65、NLRP3、GSDMD、ASC mRNA表达,p65、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.01),IκBα蛋白表达升高(P<0.01)。结论岩白菜素可以通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路和调节代谢发挥治疗小鼠IPF的作用。

桂枝白虎汤对痛风性关节炎大鼠NLRP3炎症小体及TLR4/NF-κB通路的调节作用研究

目的:研究桂枝白虎汤对痛风性关节炎大鼠NLRP3炎症小体及TLR4/NF-κB通路的调节作用。方法:72只SD大鼠随机分为正常对照组(12只)及造模组(60只),采用注射尿酸钠法建立痛风性关节炎大鼠模型,成模大鼠随机分为模型组、秋水仙碱(1 mg/kg)阳性对照组及桂枝白虎汤低(7 g/kg)、中(14 g/kg)、高(28 g/kg)剂量组,每组12只,各给药组灌胃给药,模型组及正常对照组灌胃相应体积生理盐水,1次/d,连续7 d,检测大鼠步态级别、踝关节肿胀度及关节炎症指数,酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8、UA、β-gal、NAG、SOD、MDA水平及关节腔冲洗液IL-1β、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平,HE染色法检查大鼠踝关节滑膜组织病理学,免疫组化法检测滑膜组织NLRP3表达,RT-qPCR及Western Blot检测大鼠踝关节滑膜组织TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA及蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠步态级别、踝关节肿胀度、关节炎症指数及血清IL-1β、TNF-α、IL-8、UA、β-gal、NAG、MDA水平和关节腔冲洗液IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA水平显著升高,血清及关节腔冲洗液SOD水平显著降低,滑膜MC数量、活化MC数量、活化MC百分率和踝关节滑膜组织TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组大鼠步态级别、踝关节肿胀度、关节炎症指数及血清IL-1β、TNF-α、IL-8、UA、β-gal、NAG、MDA水平和关节腔冲洗液IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA水平显著降低,血清及关节腔冲洗液SOD水平显著升高,滑膜MC数量、活化MC数量、活化MC百分率及踝关节滑膜组织TLR4、NF-κB、NLRP3 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。桂枝白虎汤的作用呈剂量依赖性。结论:桂枝白虎汤能显著抑制痛风性关节炎大鼠NLRP3炎症小体水平,抑制大鼠关节炎症损伤,提高抗氧化应激损伤能力,改善关节组织病理学,其机制可能与调节TLR4/NF-κB通路有关。

厚朴酚调节MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路对动脉粥样硬化大鼠主动脉炎性损伤的影响

目的:探讨厚朴酚(Mag)对动脉粥样硬化(AS)大鼠主动脉炎性损伤及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚结构域样受体家族含吡啉结构域蛋白3(NLRP3)信号通路的影响。方法:从50只SD大鼠中随机选择10只作为对照组(NC组),其余构建AS模型后随机分为模型组(AS组)、Mag组(25 mg/kg)、阳性组(100 mg/kg地奥心血康)、Mag+通路激活剂组(Mag+1μg LPS组),每组10只。ELISA试剂盒检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,计算动脉硬化指数(AI);油红染色观察主动脉病理切片;流式细胞术检测外周血Th17/Treg细胞表达;RT-qPCR检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA、基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA表达情况;Western bloting检测MAPK/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达。结果:AS组主动脉较NC组出现斑块沉积、大量炎症细胞浸润等现象,TC、TG、LDL-C、Ox-LDL、AI指数、IL-6、IL-1β、TNF-α、Th17细胞水平、Th17/Treg比例、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平,以及NLRP3、p-MAPK/MAPK、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平显著增高(P<0.05),HDL-C、Treg细胞水平显著下降(P<0.05);与AS组比较,Mag组、阳性组主动脉损伤现象有所改善,TC、TG、LDL-C、Ox-LDL、AI指数、IL-6、IL-1β、TNF-α、Th17细胞水平、Th17/Treg比例、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平,以及NLRP3、p-MAPK/MAPK、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平显著下降(P<0.05),HDL-C、Treg细胞水平显著升高(P<0.05)。而通路激活剂LPS可明显减弱Mag对AS大鼠主动脉炎性损伤的改善效果。结论:Mag可能通过抑制MAPK/NF-κB/NLRP3通路,缓解AS大鼠主动脉炎性损伤。

枸杞多糖通过抑制NF-κB/NLRP3通路减少视网膜色素变性小鼠感光细胞凋亡

目的探讨枸杞多糖可否通过抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链增强子/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NF-κB/NLRP3)信号通路减少视网膜色素变性(RP)小鼠视网膜光感受器细胞的凋亡。方法(1)体外实验将小鼠视网膜神经节细胞(661W细胞)分为正常组、模型组、枸杞多糖低剂量组(40 mg/L)、中剂量组(80 mg/L)、高剂量组(160 mg/L)和阳性药物对照组(NLRP3抑制剂,160 mg/L);分别用50、100、200和400μmol/L四种剂量的H_(2)O_(2)干预661W细胞,选出最佳H_(2)O_(2)浓度(200μmol/L)造模,细胞计数试剂盒CCK-8测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫荧光检测NLRP3标志物的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹法(WB)检测细胞凋亡标志物的表达。(2)选用C57/BL6小鼠和Rd10小鼠进行体内实验,分组为正常组、模型组、枸杞多糖低剂量组(0.08 g/d)、中剂量组(0.16 g/d)、高剂量组(0.32 g/d)和阳性药物对照组(NLRP3抑制剂,0.08 g/d),其中正常组为C57/BL6小鼠,其余组为Rd10小鼠,每组10只,相对应的药物连续灌胃4周,通过视网膜电图、组织病理学检查和WB等方法观察NF-κB/NLRP3通路及细胞凋亡标志物的表达,评估枸杞多糖对视网膜光感受器细胞凋亡的影响。结果(1)体外实验中,与正常组相比,模型组661W细胞凋亡率明显增加(P<0.01),且NF-κB/NLRP通路关键蛋白NLRP3、NF-κB、p-NF-κB和促凋亡蛋白caspase-3的表达水平上调(P<0.01),Bax/Bcl-2的比值增大(P<0.01),白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度显著升高(P<0.01)。与模型组相比,高剂量的枸杞多糖降低了661W细胞的凋亡率(P<0.01),下调了NF-κB/NLRP3通路关键蛋白NF-κB、NLRP3、p-NF-κB和caspase-3的表达(P<0.01),减小了Bax/Bcl-2的比值(P<0.01),降低了IL-1β和TNF-α的浓度(P<0.01)。(2)体内实验中,高剂量的枸杞多糖显著增加了Rd10小鼠外核层(ONL)厚度的形态变化以及a波和b波振幅的功能变化(P<0.01),下调了NF-κB(P<0.05)、NLRP3、p-NF-κB和caspase-3的表达水平(P<0.01),减小了Bax/Bcl-2的比值(P<0.01),降低了IL-1β(P<0.01)和TNF-α(P<0.05)的浓度。结论枸杞多糖可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路改善视网膜形态和功能,保护光感受器免受细胞凋亡的影响。

基于BRD4/NF-κB/NLRP3通路介导的巨噬细胞焦亡探讨三石汤抑制痛风性关节炎的分子机制研究

目的:观察三石汤对BRD4/NF-κB/NLRP3通路介导的巨噬细胞焦亡的影响,从而阐明三石汤抑制痛风性关节炎的分子机制。方法:以佛波酯诱导THP-1人单核细胞株分化巨噬细胞,并分为空白组、模型组、三石汤低剂量、中剂量、高剂量和BRD4抑制剂组。除空白组外,余下各组以尿酸单钠结晶诱导构建痛风性关节炎细胞模型。分别采用CCK8检测巨噬细胞的活性,流式细胞术检测巨噬细胞焦亡水平,酶联免疫吸附法检测LDH的活性和IL-1β及IL-18的含量,Western blot检测BRD4/NF-κB/NLRP3通路中相关蛋白的表达。结果:与空白组比较,模型组巨噬细胞活性下降,焦亡水平、LDH活性、IL-1β与IL-18含量、BRD4、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 p20和IL-1β蛋白的表达均显著的上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,三石汤组巨噬细胞活性上调,焦亡水平、LDH活性、IL-1β与IL-18含量、BRD4、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 p20和IL-1β蛋白表达均显著的下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:三石汤通过抑制BRD4/NF-κB/NLRP3通路激活抑制巨噬细胞焦亡,从而改善痛风性关节炎的炎症水平。

利拉鲁肽基于NF-κB/NLRP3通路对超重/肥胖糖尿病前期的干预研究

目的探讨利拉鲁肽基于核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)通路对超重/肥胖糖尿病前期患者的作用。方法选取2020年4月至2021年3月杭州市中医院收治的超重/肥胖糖尿病前期患者60例,根据随机数字表法将其分为对照组和观察组,每组各30例。对照组患者进行生活方式干预,观察组患者在此基础上给予利拉鲁肽皮下注射。两组患者均干预12周。比较两组患者干预前后的体质量指数(body mass index,BMI)、血糖相关指标[糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、餐后2h血糖(2h postprandial blood glucose,2hPBG)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、餐后2h胰岛素(2h postprandial insulin,2hPINS)、稳态模型评估的胰岛素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)指数]、血脂指标[三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)]、炎症因子[白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、NF-κB、NLRP3蛋白表达水平。结果观察组患者的BMI、FBG、2hPBG、FINS、2hPINS、HbA1c、HOMA-IR指数、TG、TC、LDL-C、IL-6、IL-1β、TNF-α及NF-κB、NLRP3蛋白表达水平均显著低于同期对照组(P<0.05),HDL-C显著高于同期对照组(P<0.05)。观察组患者的IL-6、IL-1β、TNF-α与HOMA-IR指数均呈正相关(r=0.615,0.327,0.343,P<0.05)。结论利拉鲁肽通过抑制NF-κB/NLRP3通路减轻炎症反应,可降低超重/肥胖糖尿病前期患者的体质量,改善糖脂代谢紊乱。

藤黄健骨胶囊通过SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路调节绝经后骨质疏松大鼠破骨细胞分化

目的:探讨藤黄健骨胶囊(TJC)对绝经后骨质疏松大鼠沉默信息调节因子1(SIRT1)/核因子κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路关键蛋白表达的影响及分子机制。方法:采用随机数字表法将SD雌性大鼠分为假手术组,模型组[卵巢切除术(OVX)组],SIRT1抑制剂组(EX-527+OVX组),阳性药物戊酸雌二醇(ESV)对照组(ESV+OVX组),以及高、中、低剂量TJC处理组(TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJCL+OVX组),每组10只。OVX建模,建模成功后给予TJC或ESV干预,并根据实验设计给予EX-527干预,8周后取材。ELISA法检测相关炎症因子水平;双重免疫荧光染色分别检测SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白;RT-qPCR和Western blot分别检测SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路相关分子和破骨分化标志分子的mRNA和蛋白水平。结果:与假手术组相比,OVX组和EX-527+OVX组大鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量显著升高(P<0.01),破骨细胞NF-κB p65及NLRP3表达荧光面积显著增大(P<0.01),股骨组织NF-κB p65、NLRP3和活化T细胞核因子胞浆1型(NFATc1)mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.01),而破骨细胞SIRT1表达荧光面积显著减小(P<0.01);与OVX组相比,高剂量TJC处理组大鼠血清IL-1β含量和股骨组织NLRP3蛋白表达水平均显著降低,中、高剂量TJC处理组大鼠血清IL-18含量及股骨组织NF-κB p65和NFATc1蛋白表达水平均显著降低,低、中、高剂量TJC处理组大鼠血清TNF-α含量、破骨细胞NF-κB p65和NLRP3表达荧光面积、股骨组织NF-κB p65、NLRP3及NFATc1 mRNA水平均显著降低,而破骨细胞SIRT1表达荧光面积显著增大(P<0.05);与EX-527+OVX组相比,高剂量TJC处理组大鼠股骨组织NLRP3蛋白表达水平显著降低,中、高剂量TJC处理组大鼠血清IL-1β及IL-18含量、股骨组织NF-κB p65和NFATc1蛋白表达水平均显著降低,低、中、高剂量TJC处理组血清TNF-α含量、破骨细胞NF-κB p65和NLRP3表达荧光面积、股骨组织NF-κB p65、NLRP3及NFATc1 mRNA水平均显著降低,而破骨细胞SIRT1表达荧光面积显著增大(P<0.05)。结论:TJC能够抑制绝经后骨质疏松模型大鼠破骨细胞分化,其作用机制可能与抑制SIRT1/NF-κB/NLRP3信号通路激活、减轻炎症反应有关。