NF-κB圈套寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响

目的探讨NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术(NF-κB decoy ODN)联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响。方法培养人肺癌细胞A549:(1)用脂质体瞬时转染法介导NF-κB全硫代圈套寡核苷酸(decoy ODN)和全硫代错义圈套寡核苷酸(scramble decoy ODN)处理A549细胞;(2)分为对照组、NF-κB decoy ODN组、紫杉醇组(1 000 ng/mL)和NF-κB decoy ODN+紫杉醇组,RT-PCR法测COX-2 mRNA水平表达;(3)免疫组织化学法测VEGF蛋白表达。结果 NF-κB decoy ODN、紫杉醇干预后A549细胞的COX-2 mRNA水平表达下降,对照组、NF-κB decoy ODN组、紫杉醇组、NF-κB decoy ODN+紫杉醇组浓度依次是:(0.71±0.04)μg/μL、(0.44±0.08)μg/μL、(0.51±0.02)μg/μL、(0.34±0.05)μg/μL(P<0.05)。VEGF蛋白表达亦下降,各组细胞阳性率依次是:(85±0.50)%、(63±0.26)%、(57±1.5)%、(21±0.34)%(P<0.05)。结论 NF-κB decoy ODN联合紫杉醇可明显抑制肺癌细胞血管生成,该作用可能与COX-2、VEGF表达相关。

NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术的发展和应用

NF κB是一种重要的核转录因子 ,可被多种刺激因素激活 ,并转位至细胞核 ,与相应的靶基因结合 ,启动基因转录。NF κB的靶基因包括编码细胞因子、粘附分子、诱导型一氧化氮合酶等的基因 ,因此与多种炎性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的发生有关。人工合成的双链NF κB圈套寡脱氧核苷酸含有NF κB结合位点 ,可与游离的NF κB结合 ,从而圈套了NF κB ,阻止其活化。NF κB圈套寡脱氧核苷酸已成功用于多种疾病的发病机制及治疗学研究 。

NF-κB圈套寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对肺癌细胞增殖凋亡的影响

探讨NF-κB圈套寡脱氧核苷酸(NF-κB decoy ODN)联合紫杉醇对肺癌细胞增殖凋亡的影响。培养人肺癌细胞A549:(1)脂质体瞬时转染细胞;(2)MTT试验观察细胞生长曲线;(3)流式细胞术检测细胞凋亡率。NF-κB decoyODN使细胞生长受到抑制,NF-κBdecoy ODN联合紫杉醇使细胞凋亡增加。NF-κB decoy ODN联合紫杉醇可增强对肺癌细胞增殖的抑制及凋亡的诱导。

寡聚脱氧核苷酸抑制巨噬细胞NF-κB活性的实验研究

目的观察寡聚脱氧核苷酸(ODN)对THP-1细胞NF-κB核转位及细胞核内结合活性的抑制作用。方法用脂质体将寡聚脱氧核苷酸转入细胞后,以细菌脂多糖(LPS)刺激30min,分别通过免疫细胞化学、电泳迁移率分析(EMSA)和 RT-PCR检测细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB结合活性。结果免疫细胞化学显示转入ODN后以LPS刺激, NF-κB表达仍位于细胞浆内,EMSA显示ODN可明显抑制细胞核内结合活性,RT-PCR显示ODN能够明显抑制 NF-κB相关炎性因子TNF-α mRNA的合成。结论ODN能有效抑制THP-1细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB 结合活性,从而抑制相关炎性基因的启动和转录。

核因子-κB寡脱氧核苷酸策略对胶原诱导关节炎大鼠细胞因子调节研究

目的:探讨核因子-κB(NF-KB)寡脱氧核苷酸(ODN)局部应用对Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠的治疗作用及机制。方法:建立Ⅱ型CIA大鼠模型,用NF-κB圈套ODN注射到大鼠右后踝关节腔内,并设空白对照组、CIA模型组和实验组。42 d后观察各组关节炎指数、病理指标,采用酶联免疫吸附试验法检测各组大鼠血清和关节液中白细胞介素(IL)-17、IL-12和转化生长因子-β(TGF-β)的水平。结果:与空白对照组比较,CIA模型组大鼠血清和关节液中IL-17和IL-12水平均明显升高,而TGF-β水平显著降低(P<0.01),而实验组经NF-κB圈套ODN注射后,与CIA模型组比较,血清和关节液中IL-17和IL-12水平均明显降低,而TGF-β水平显著升高(P<0.01)。结论:NF-κB圈套ODN明显抑制CIA大鼠外周血和关节液中IL-17、IL-12的产生,促进TGF-β水平的增加,对CIA有较好的治疗作用。

Ciglitazone在NF-κB圈套寡核苷酸抑制肝癌细胞增殖中的作用

目的:观察核转录因子-κB圈套寡核苷酸抑制NF-κB活性后,肝癌HepG2细胞对ciglitazone敏感性的变化。方法:运用基因转染技术将NF-κB圈套寡核苷酸转染入肝癌HepG2细胞中,检测转染前后NF-κB活性。再用ciglitazone处理转染细胞,描记HepG2细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测处理前后细胞周期素D1(Cyclin D1)的变化。结果:转染后的肝癌HepG2细胞NF-κB活性明显降低;ciglitazone抑制HepG2细胞增殖作用增强,70.65%的细胞被阻滞于G1/G0期,Cyclin D1表达明显下降。结论:NF-κB圈套寡核苷酸能增加肝癌HepG2细胞对ciglitazone的敏感性,可能与其下调NF-κB的活性、增强ciglitazone抑制肝癌细胞增殖和阻滞细胞周期有关。

针对SP1的圈套寡脱氧核苷酸抑制NIH_3T_3细胞活力和Ⅲα_1胶原基因表达的研究

目的:研究针对转录因子SP1的圈套寡脱氧核苷酸(Decoy-Oligodeoxynucleotide,Decoy-ODN)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的活力和Ⅲα1胶原基因表达的影响,探讨圈套寡脱氧核苷酸用于病理性瘢痕基因治疗的可能性及机理。方法:设计合成针对SP1的特异性哑铃形Decoy-ODN。用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞。分别用流式细胞仪检测ODN转染效率,激光共聚焦显微镜观察ODN在细胞中的分布,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证ODN与SP1的特异性结合。用WST-8检测ODN对细胞活力的影响。用RT-PCR检测ODN对细胞胶原基因表达的抑制作用。结果:分别转染25nM、50nM、100nM、150nM SP1 Decoy-ODN,48h后,细胞活力依次为0.9331±0.0203、0.7479±0.0868、0.577±0.0347、0.4703±0.0147;转染100nMSP1Decoy-ODN可明显抑制Ⅲα1胶原mRNA的表达(P<0.01),抑制效果达60%。结论:Decoy-ODN可以通过拮抗核转录因子SP1的活性而抑制NIH3T3细胞的活力和Ⅲα1胶原基因的表达。

苦豆碱通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路改善香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤

目的探究苦豆碱(Alo)对香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤的作用及其可能的作用机制。方法16HBE人支气管上皮细胞经100 mL/L香烟烟雾提取物(CSE)和(50、100、200)μmol/L Alo共处理后,CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、Western blot法检测细胞凋亡,ELISA检测炎性因子水平;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针和相关试剂盒检测氧化应激水平;Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)通路相关蛋白表达水平。16HBE细胞经100 mL/L CSE和200μmol/L Alo共处理后,采用上述方法检测过表达TLR4对TLR4/NF-κB/NLRP3通路、细胞LDH活性、凋亡、炎症反应及氧化应激的影响。结果CSE暴露可降低16HBE细胞活力,增加LDH释放和细胞凋亡,增强炎症反应和氧化应激水平,且激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路;经Alo处理后,细胞活性升高,LDH释放减少、凋亡降低、炎症减轻、氧化应激水平下降,且TLR4/NF-κB/NLRP3通路失活;TLR4过表达可逆转Alo处理对CSE诱导的16HBE细胞损伤的保护作用。结论Alo可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路减轻CSE诱导的人支气管上皮细胞损伤。

靶向核因子κB的圈套核苷酸策略在疾病研究中的应用

圈套核苷酸技术是一种新型的抑制转录因子转录激活的基因操作技术,目前已广泛应用于疾病研究。核因子κB(NF-κB)圈套核苷酸是针对κB序列(5′-GGGACTTTCC-3′)设计的双链核苷酸序列,其可与活化的NF-κB二聚体结合而抑制目的基因的转录表达。NF-κB圈套核苷酸是目前研究应用最多的圈套核苷酸,已在肿瘤、心血管、神经、风湿、呼吸、肾脏和器官移植等相关疾病的治疗性研究中获得肯定的疗效。

转录因子诱杀性寡聚核苷酸抑制NF-κB基因治疗的研究

核因子 κB(NF κB)是一种很重要的转录因子 ,其过度表达与许多疾病的免疫病理机制有关。国内外有关以NF κB为靶点的拮抗治疗策略很多 ,目前针对NF κB基因治疗已经成为非常有吸引力的治疗方法。近年的研究发现 ,诱杀性寡聚核苷酸抑制NF κB靶性基因治疗利用外源性含有转录因子结合序列的寡聚核苷酸来操纵转录因子和其他调节因子的基因表达 ,达到治疗疾病的目的 ,在实验中取得了一些可喜成果 ,但有局限性 ,临床应用尚需进一步研究。

诱骗寡聚脱氧核苷酸在疾病治疗中的研究进展

诱骗寡聚脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,decoy ODN)通过与目的基因启动子上的转录因子结合位点(trascription factor binding site,TFBS)竞争性地结合转录因子,从而影响转录因子调控的靶基因表达。近年来,越来越多的研究者证实通过识别各种疾病相关的信号通路与转录因子,设计相应的decoy ODN,可以对一些疾病起到治疗效果,这其中包括运用STAT3 decoy ODN治疗恶性肿瘤和运用NF-κB decoy ODN治疗炎症纤维化疾病和心血管疾病。本文将总结分析近5年decoy ODN策略在疾病研究中的运用,为治疗肿瘤、纤维化、心脑血管病等疾病提供新的思路。

基于NLRP3-IL-1β-NF-κB信号轴研究野菊花总黄酮对脂多糖诱导HK-2细胞炎性反应及自噬的影响

目的探究野菊花总黄酮(TFC)对脂多糖(LPS)诱导HK-2细胞炎性反应及自噬的影响,并初步探究其可能的作用机制。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,将细胞分为阴性对照(Control)组、LPS处理(LPS)组、TFC预处理(TFC)组、NLRP3激活预处理(4-MET)组、TFC联合4-MET预处理(TFC+4-MET)组。CCK-8法检测细胞增殖情况;Hoechst 33342染色观察各组细胞形态变化;免疫印迹法检测各组细胞核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(Asc)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、p-IκB、IκB、自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、蛋白表达情况;ELISA法检测细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL-18水平;透射电镜观察细胞自噬情况。结果与Control组相比,LPS组细胞增殖率降低,细胞核破碎情况加重,细胞凋亡率升高,NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达升高、IκB蛋白磷酸化水平升高,IL-1β、IL-18水平升高,LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05)。与LPS组相比,TFC组细胞增殖率升高,细胞核破碎减轻,细胞凋亡率降低,NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达降低、IκB蛋白磷酸化水平降低,IL-1β、IL-18水平降低,细胞自噬程度增加,LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达升高;4-MET组细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高,细胞核破碎情况加重,NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达升高、IκB蛋白磷酸化水平升高,IL-1β、IL-18水平升高,细胞自噬程度降低,LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05)。TFC+4-MET组细胞增殖率、细胞自噬程度、LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达高于4-MET组,细胞核破碎情况减轻,细胞凋亡率、NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达、IκB蛋白磷酸化、IL-1β、IL-18水平低于4-MET组(P<0.05)。结论野菊花总黄酮可能通过抑制NLRP3-IL-1β-NF-κB信号通路活化,进而抑制脂多糖诱导HK-2细胞炎性反应,诱导细胞自噬。

NF—κB双链寡脱氧核苷酸圈套对严重肺挫伤兔呼吸功能及炎性因子表达的影响

目的研究NF—κB双链寡脱氧核苷酸圈套（NF—κB decoy oligodeoxynucleotides，NF—κB decoy ODN）对严重胸外伤肺挫伤早期呼吸功能及血清炎性因子IL-1β、IL-13表达的影响。方法40只新西兰白兔用随机数字表法分为严重胸外伤肺挫伤组（挫伤组，12只）、严重胸外伤肺挫伤NF—κB杂链decoy ODN治疗组（杂链组，12只）、严重胸外伤肺挫伤NF—κB正链decoy ODN治疗组（正链组，12只）、对照组（正常无损伤组，4只）。建立严重胸外伤肺损伤模型，按实验分组分别将合成的正链、杂链NF—κB decoy ODN经颈内静脉注入，每只实验兔分别注射20μg。于肺挫伤后1，2，3，4h监测呼吸频率、潮气量、气道压力、呼吸流率曲线及呼气末CO2浓度，经颈动脉抽取血标本，ELISA法检测血清炎性因子IL-1β、IL-13的表达。结果肺挫伤后经NF—κB正链decoy ODN治疗后，肺泡通气量、动脉血氧分压、肺顺应性逐渐上升，肺泡一动脉血氧分压差逐渐下降直至接近正常水平，与挫伤组和杂链组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。杂链组上述指标略有变化，但与挫伤组比较，差异无统计学意义（P〉0．01）。血清炎性因子IL-1β在挫伤后1h升至高峰，并持续至实验结束，IL-13的表达在肺挫伤后1h下降，4h降至最低值。经正链decoy ODN治疗后可使挫伤后显著升高的IL-1β明显降低，而IL-13的表达维持于高水平，与挫伤组、杂链组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论在严重胸外伤肺挫伤早期呼吸功能出现损害时给予NF—κB正链decoy ODN治疗，对挫伤肺通气功能、换气功能、呼吸力学有明显的保护作用，且血清炎性因子IL-1β的表达减少，IL-13表达升高。

糖尿病患者树突细胞中NF-κB活性改变及检测TNF-α意义

目的探讨糖尿病患者血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平及外周血树突细胞(DC)中NF-κB活性变化的意义。方法无偿献血员10例为正常对照组(N组),糖尿病患者20例分为IDM组和ODN组各10名。外周血分离单核细胞(PBMC),加入IL-4、GM-CSF对DC进行诱导培养,同时向ODN组中加入NF-κB特异性低脱氧核苷酸(ODN)培养细胞,采用ELISA法测定血液及培养上清中TNF-α的含量。免疫印迹分析检测DC中NF-κB p65的磷酸化水平,β-actin作为内参。结果糖尿病组患者的血清TNF-α水平显著高于正常对照组(P<0.001);培养物上清液TNF-α水平的测定结果为:N组和ODN组显著低于IDM组(P<0.05);N组和ODN组水平无显著差异(P>0.05);在N组和ODN组DC中NF-κB p65的磷酸化的表达水平显著地低于IDM组(P<0.05);N组和ODN组无显著差异(P>0.05)。结论提示炎症因子TNF-α及NF-κB可能参与糖尿病的病理生理过程。糖尿病患者外周血树突细胞中NF-κB p65的磷酸化水平可以被ODN抑制。

NF-κB在泌尿系肿瘤中的研究进展

核凶子κB（nuclearfactor-kappa B．NF-κB）义称核转录凶子．具有和某些基因上启动子区的同定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能。在非激活条件下，NF-κB在大多数细胞类型的细胞浆内与其抑制蛋白IκB家族紧密结合而呈无活性状态。NF-κB在激活后，从细胞质进入细胞核参与调控多种基因的转录。

高核苷酸酵母水解物对脂多糖诱导RAW264.7细胞免疫调节的影响

为探讨高核苷酸酵母水解物对RAW264.7小鼠巨噬细胞免疫活性调节及其相关作用机制,采用脂多糖(1μg/mL)刺激RAW264.7细胞来建立体外细胞炎症模型,以不同质量浓度的高核苷酸酵母水解物干预来明确其抗炎效果。ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的含量,RT-PCR法检测相关mRNA表达水平,Western blot法检测细胞iNOS及胞核内核转录因子NF-κBp65蛋白水平。结果表明:高核苷酸酵母水解物作用RAW264.7细胞的安全范围≤150μg/mL。与LPS模型组相比,质量浓度60～150μg/mL的高核苷酸酵母水解物能显著增强RAW264.7吞噬能力,高核苷酸酵母水解物(60～150μg/mL)能有效抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW264.7细胞释放NO、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子及相关mRNA表达,降低iNOS及NF-κB蛋白水平。研究结果证实了高核苷酸酵母水解物对LPS刺激RAW264.7细胞炎症的保护作用,作用机制与NF-κB通路有关,为食疗干预慢性病提供一定的理论依据。

核糖核苷酸还原酶M2下调抑制人宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭

核糖核苷酸还原酶M2(ribonucleotide reductase, RRM2)在多种癌症组织中高表达,这与肿瘤细胞的侵袭、转移及肿瘤血管形成等生物学行为密切相关。目前,关于以RRM2为靶点治疗宫颈癌的研究并不多,其对宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制也尚未明确。本研究采用RNA干扰技术下调RRM2,以人宫颈癌细胞株CaSki和HeLa细胞为研究对象,实验分为Ctrl-siRNA组和RRM2-siRNA组。通过RT-PCR和Western印迹检测RRM2-siRNA的干扰作用,采用CCK-8和EDU实验评价细胞的增殖和DNA合成的情况,通过划痕实验和Transwell小室侵袭实验观察细胞的迁移和侵袭能力,并用Western印迹检测NF-κB和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白质表达水平。结果显示,在CaSki和HeLa细胞中,RRM2-siRNA组RRM2的mRNA和蛋白质表达较Ctrl-siRNA组均下降(P<0.05),表明RRM2-siRNA能有效抑制RRM2的表达。与Ctrl-siRNA组相比,RRM2-siRNA组在转染24、48、72 h后,细胞增殖率下降(P<0.05)。且DNA合成率与细胞划痕愈合程度,宫颈癌细胞侵袭数量也显著下降(P<0.05)。结果表明,RRM2下调后,抑制DNA合成与细胞增殖、迁移和侵袭过程。此外,RRM2-siRNA组NF-κB和MMP-9蛋白质水平较Ctrl-siRNA组降低。本研究提示,下调RRM2抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,该作用可能通过NF-κB和MMP-9介导,这为宫颈癌中以RRM2作为靶点的治疗提供实验依据。

miR-21通过抑制A20促进小鼠RAW264.7细胞NF-κB和NLRP3的表达

目的探讨调控微小RNA21(miR-21)表达对脂多糖(LPS)刺激下RAW264.7细胞中核因子κB(NF-κB)及含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)表达的影响及机制。方法RAW264.7细胞给予100 ng/mL LPS刺激24 h后,采用实时荧光定量PCR检测miR-21表达水平;转染miR-21抑制物或模拟物调节RAW264.7细胞miR-21的表达水平,并给予LPS刺激,实时定量PCR检测其对白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β的mRNA表达的影响,Western blot法检测对NF-κB、NLRP3蛋白及NF-κB抑制分子锌指蛋白A20表达的影响。结果LPS刺激RAW264.7细胞后,miR-21表达明显升高。上调miR-21表达后,IL-6、TNF-α、IL-1β、NF-κB、NLRP3表达均上升,下调miR-21表达后,IL-6、TNF-α、IL-1β、NF-κB、NLRP3表达均下调。miR-21靶向抑制A20表达。结论miR-21促进RAW264.7细胞NF-κB、NLRP3表达,其机制可能与靶向抑制A20有关。