葡萄糖调节蛋白75对缺糖诱导的凋亡相关基因Bax和NF-κB改变的影响

目的通过已获得稳定表达葡萄糖调节蛋白（Grp75）的PC12细胞株,检测Grp75对缺糖诱导的细胞凋亡过程中Bax和NF-κB的影响。方法Grp75过表达组和对照组细胞无糖培养6h、12h2、4h和48h后,进行相关的实验。免疫印迹法检测缺糖状态下两组细胞中Grp75的表达水平和NF-κB的活性;应用半定量RT-PCR和免疫印迹法比较Bax表达水平的变化;免疫细胞化学通过构象特异性的Bax 6A7抗体检测Bax的活化。结果Bax活化和NF-κB活性的下降在缺糖诱导的PC12细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。而Grp75通过阻止Bax的活化和NF-κB活性的下降抑制缺糖诱导的凋亡。缺糖状态下Grp75过表达组和对照组细胞中Bax表达水平均未发生改变。结论Bax活化和NF-κB活性下降与缺糖诱导的PC12细胞凋亡关系密切,Grp75通过阻止Bax的活化和维持NF-κB的活性保护PC12细胞。

NF-κB在气道黏蛋白高分泌调节机制中的作用

呼吸道慢性炎症性疾病中均存在黏液高分泌,引起黏液高分泌的确切机制尚不清楚.临床观察显示,各种侵入呼吸道的刺激物如病原菌、粉尘、烟雾以及物理、化学损伤因子均可诱使气道黏液分泌显著增多.细胞内信号转导及基因调控机制介导了黏蛋白的分泌,而多种细胞内信号转导通路的研究,将涉及核转录因子(NF-κB)活化在黏蛋白高分泌中的作用.

遍在蛋白调节NF-кB信号转导通路的研究进展

NF-κB信号通路参与了多种基因的转录调控和很多重要的生理和病理过程。遍在蛋白在其中的不同的阶段发挥了不同的作用。一方面通过遍在蛋白化IκB,促使其被26S蛋白酶体识别而降解,从而释放出NF-κB进入核内,调控相应基因的表达;另一方面通过遍在蛋白化TRAF6来激活TAKI,然后进一步活化IKK。后一种途径为了解NF-κB信号通路的调控提供了新的线索,并为遍在蛋白功能的研究开辟了新的方向。

miR-9-5p通过SIRT1/NF-κB通路促进胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨miR-9-5p通过调控SIRT1及NF-κB表达对胰腺癌细胞(PANC-1)凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。方法使用miR-9-5p mimic慢病毒转染人胰腺癌PANC-1细胞建立稳转株(mimic组),空载体转染作为阴性对照组(NC组),以未处理的PANC-1细胞作为空白对照组(空白组)。采用qRT-PCR检测PANC-1细胞中miR-9-5p、SIRT1及Caspase-3 mRNA的表达水平;Western Blot检测SIRT1、NF-κB通路相关蛋白及Caspase-3蛋白表达量;ELISA检测细胞裂解液中SIRT1及Caspase-3蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验明确miR-9-5p和SIRT1的靶向关系;Pearson相关分析确定miR-9-5p、SIRT1及Caspase-3 mRNA表达的相互关系。结果mimic组miR-9-5p mRNA表达较对照组明显升高,结果有统计学意义,提示转染成功。与空白组及NC组相比,mimic组SIRT1 mRNA及蛋白表达水平下调(P<0.01),p-NF-κB p65与NF-κB p65上调(P<0.01),Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平上调(P<0.01)。双荧光素酶报告基因显示miR-9-5p可抑制野生型SIRT1细胞的荧光活性,miR-9-5p可靶向调控SIRT1的表达;Pearson相关分析发现miR-9-5p和SIRT1的表达水平呈负相关(r=-0.849,P<0.05);miR-9-5p和Caspase-3的表达水平呈正相关(r=0.796,P<0.05)。结论过表达miR-9-5p可促进PANC-1细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达,其机制可能与靶向调控SIRT1继而调节NF-κB通路有关,这将为胰腺癌的诊断及治疗提供新的思路。

原花青素通过上调SIRT1表达抑制NF-κB通路减轻脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症反应

目的探索原花青素(PC)对脂多糖(LPS)诱导下的RAW264.7细胞炎症反应的调控作用及可能机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞,分别加入PBS及不同浓度PC处理24 h后,添加1μg/mL LPS继续处理6 h。采用实时定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4、精氨酸酶1(Arg1)的mRNA表达;采用流式细胞术检测PBS组、LPS组及PC联合LPS组对巨噬细胞M1、M2型极化的影响;采用Western blot法检测不同浓度PC处理后沉默信息调节蛋白1(SIRT1)、核因子κB p65(NF-κB p65)与乙酰化的NF-κB p65(Ace-p65)的蛋白表达;采用免疫共沉淀实验检测PC处理巨噬细胞后SIRT1与NF-κB p65的结合效应。结果与PBS组相比,PC组中巨噬细胞促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA表达降低,抑炎因子IL-4、Arg1的mRNA表达升高。与LPS组相比,PC联合LPS组可显著抑制巨噬细胞M1型极化,促进M2型极化。随着PC浓度的增加,SIRT1表达呈现上调趋势,NF-κB p65蛋白未表现出显著变化,Ace-p65蛋白在高浓度PC处理时表达显著降低。PC处理可显著增强SIRT1与NF-κB p65的结合效应。结论PC可通过上调SIRT1的表达,抑制NF-κB通路,减轻LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应。

蛋白激酶C和I_kΒNF_kΒ在免疫调节中的作用

蛋白激酶C是一组重要的细胞内信号转导物质, 它磷酸化下游 元件IκB,使其活化并分解小分子蛋白NF-κB,该小分子蛋白对淋巴细胞的活化、淋巴细胞的凋亡以及淋巴细胞介导的细胞毒作用有着重要的调控作用。NF-κB与IκB-α是一组相互调节的系统,其中一个成分调节水平的改变可影响另一个成分的活性;这些成分活性的改变又可反馈性调节PKC的活性。

SIRT1对高糖诱导的系膜细胞NF-κBp65乙酰化及MCP-1表达的影响

目的探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(RMC)核因子κB(NF-κB)p65蛋白乙酰化及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达的影响。方法构建干扰SIRT1基因的shRNA慢病毒质粒pTRCshSIRT1并进行鉴定。将RMC分为高糖组(用高糖培养液培养)、白藜芦醇(SIRT1激活剂)+高糖组(用含1μmol/L白藜芦醇的低糖培养液培养24h后,换用高糖培养液培养)、SIRT1RNAi组(添加干扰病毒pTRC-shSIRT1感染4h后,换用低糖培养液培养)、SIRT1RNAi+高糖组(添加干扰病毒pTRC-shSIRT1感染4h后,换用高糖培养液培养),同时设正常对照组和甘露醇高渗对照组。以实时荧光定量PCR检测SIRT1、MCP-1的mRNA表达,蛋白质印迹法检测SIRT1和NF-κB p65乙酰化蛋白的表达,ELISA技术检测MCP-1蛋白含量。结果质粒测序证实干扰SIRT1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,且能抑制RMC中SIRT1基因表达(P<0.01)。高糖刺激使RMC SIRT1基因表达降低,NF-κB p65蛋白乙酰化增强,MCP-1mRNA和蛋白水平增高;SIRT1激活剂白藜芦醇可逆转高糖引起的变化;而沉默SIRT1可促进高糖诱导的RMC NF-κB p56乙酰化及MCP-1mRNA和蛋白表达(P<0.05或0.01)。结论 SIRT1可抑制高糖诱导的RMC MCP-1表达,其机制可能与NF-κB p56去乙酰化有关。

脂多糖激活靶细胞NF-κB的机制与途径的研究进展

真核细胞核转录因子Rel/NF-κB是近年来发现的一类具有多向性转录调控作用的蛋白质因子,广泛调控着自昆虫至人类的免疫和炎症反应中一系列基因的表达。静息时,Rel/NF-κB二聚体与其抑制蛋白IκB结合成三聚体存在于胞质中,胞外刺激通过不同的信号转导途径使IκB降解,活化的NF-κB进入核内发挥功能。本文本要介绍了脂多糖激活靶细胞NF-κB的分子机制及酪氨酸蛋白激酶、丝裂原激活的蛋白激酶、蛋白激酶C等相关胞内信号转导途径的研究进展。

ERK_(1/2)和NF-κBp65在EMs模型大鼠内膜中的表达及意义

目的:探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK_(1/2))和核因子κB(NF-κBp65)在子宫内膜异位症(EMs)模型大鼠内膜组织中的表达及其与增殖和侵袭的关系。方法:选取雌性未孕SD大鼠20只,自体移植法诱导建立EMs大鼠模型,其中对照组10只。采用免疫组织化学法(IHC)及Western blot法检测各组大鼠子宫内膜组织中ERK_(1/2)和NF-κBp65蛋白表达;增殖相关蛋白(PCNA)、侵袭相关蛋白(MMP9)表达,验证异位病灶组织增殖和侵袭性的变化。结果:EMs模型大鼠病灶局部可见移植物体积增大呈透明或者半透明,内含淡黄色清亮或者咖啡色液体的囊状结构,表面及周围可见血管形成。苏木素伊红染色可见异位病灶组织内腺体、间质或者腺上皮细胞生长。免疫组化结果显示ERK_(1/2)主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中,间质内少量表达,胞核内极少量表达。NF-κBp65主要表达于子宫内膜腺体和间质的胞核,胞浆中少量表达。Western blot结果显示,EMs模型大鼠异位组及在位内膜组ERK_(1/2)和NF-κBp65蛋白表达水平高于对照组,且EMs异位内膜组表达水平高于EMs在位内膜组(P<0.05);与对照组相比,PCNA和MMP9蛋白在EMs模型大鼠异位组及在位内膜组的表达明显增高,且EMs异位内膜组表达高于EMs在位内膜组(P<0.05)。Pearson相关分析显示ERK_(1/2)和NF-κBp65蛋白表达水平呈正相关(异位内膜组r=0.657,P<0.05;在位内膜组r=0.709,P<0.05)。结论:ERK_(1/2)与NF-κBp65在EMs大鼠模型在位内膜及异位内膜组织中表达增高,可能影响异位内膜的增殖、侵袭能力,继而促进了EMs的发生发展。

核转录因子NF-κB与胃肠道肿瘤的关系

同一机体的不同细胞中特定基因的顺式元件(cis-acting elements)完全相同，其所起的特异表达，主要受制于染色体上的蛋白因子的调控。这些因子多属于非组蛋白，在其结构中有一个与DNA结合的结合区，与特定的基因上的顺式元件相结合。这种能与顺式元件结合的蛋白因子称为反式作用因子(trans-acting dements)。基因由反式作用因子与相应的顺式元件结合而启动表达。

CD1d通过信号调节蛋白α抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等炎性因子的表达

背景:核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性因子被证实与多种炎症性疾病相关,调控其表达将成为治疗相关疾病的关键。目的:验证CD1d参与了调控NLRP3炎性因子表达,并且进一步证明CD1d是通过信号调节蛋白α(signal regulatory protein-α,SIRPα)来达到调控目的。方法:①使用Flag-CD1d、HA-SIRPα慢病毒过表达载体转染293T细胞进行免疫共沉淀实验,验证CD1d与SIRPα的相互作用;②使用Flag-CD1d慢病毒过表达载体转染RAW264.7细胞,RT-qPCR检测NLRP3等基因表达;③使用HA-SIRPα慢病毒过表达载体转染RAW264.7细胞,在脂多糖刺激后RT-qPCR、Western blot检测NLRP3等基因和蛋白表达;④使用SIRPα慢病毒RNAi载体转染RAW264.7细胞,在脂多糖刺激后RT-qPCR、Western blot检测NLRP3等基因和蛋白表达。结果与结论:①免疫共沉淀实验证实CD1d与SIRPα存在相互作用;②过表达CD1d基因后,NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达明显低于正常组(P<0.05);③在脂多糖刺激后过表达SIRPα组NLRP3基因表达明显低于正常组(P<0.05);pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达与正常组差异无显著性意义(P>0.05);过表达SIRPα组p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达明显低于SIRPα干扰组(P<0.01);④脂多糖刺激后干扰SIRPα组NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达明显高于正常组(P<0.05);干扰SIRPα组p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达明显高于过表达SIRPα组(P<0.01);⑤结果表明,CD1d与细胞膜上SIRPα形成复合物,通过SIRPα抑制下游p38MAPK/NF-κB通路,最终达到抑制NLRP3等炎性因子表达的目的。

乳源酪蛋白糖巨肽作用人结肠癌细胞HT-29调控炎症活力研究

为进一步阐释乳源酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)的抗炎及修复肠道炎症的功效,本研究在确定了乳源CGMP对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的结肠癌细胞HT-29NF-κB亚单位p65蛋白的影响和乳源CGMP调控核转录因子(nuclear factor,NF)-κB信号通路的基础上,通过构建表达乳源CGMP和NF-κB必需调节蛋白(NF-κB essential modulator,NEMO)的质粒,共转HT-29细胞,免疫共沉淀测定两个蛋白的相互作用。最后采用线粒体膜电位法测定乳源CGMP对HT-29细胞的促凋亡作用。结果表明,乳源CGMP与NEMO(NF-κB essential modulator)30 h共转HT-29细胞中,乳源CGMP与NEMO蛋白均表达,且表现出二者的相互作用。乳源CGMP可与NEMO相互作用影响NF-κB信号通路;同时乳源CGMP还促进HT-29细胞凋亡,呈时间依赖性,其中0.1μg/m L的CGMP作用效果最好。乳源CGMP与NEMO相互作用是间接作用于IκB激酶(IκB kinase,IKK)而作用于?IκB,进而影响NF-κB信号通路。研究揭示了乳源CGMP调控NF-κB信号通路的另一种途径,也充分说明乳源CGMP可通过作用多种抗炎途径发挥其调控作用。

NBD多肽的临床应用研究进展

核因子 κB(nuclearfactor κB ,NF κB )在免疫应答、炎症反应和细胞凋亡的过程中发挥着重要作用 ,已经成为相关疾病治疗的新靶点。NF κB必需调节蛋白结合区 (NF κBessentialmodifierbindingdomain ,NBD)多肽是仅有 6个氨基酸残基的小分子肽 ,它可以与IκB激酶 (IKK)的调节亚基 (NF κBessentialmodifier ,NEMO)结合 ,阻止IKK激活 ,从而选择性地抑制NF κB的过度表达。将对许多炎症性疾病、免疫性疾病和肿瘤的治疗起到重要作用。

HBXIP抑制补体介导的细胞毒活性促进肝癌免疫逃逸的机制研究

目的:探讨乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)对补体介导的细胞毒活性的影响及其在肝癌细胞免疫逃逸中的作用。方法:构建NC-shRNA和HBXIP-shRNA慢病毒稳定细胞系,台盼蓝染色检测HBXIP对补体介导的细胞毒作用的影响;Western blot检测HBXIP对CD46、CD55和CD59表达的影响;免疫荧光检测HBXIP对NF-κB活性的影响;HBXIP-shRNA细胞中过表达NF-κB,Western blot检测CD46、CD55和CD59表达变化。结果:HBXIP-shRNA细胞补体介导的细胞毒作用显著高于NC-shRNA细胞(P<0.05)。与NC-shRNA细胞相比,HBXIP-shRNA细胞CD46、CD55、CD59表达显著下降,NF-κB活性明显降低(P<0.05)。HBXIP-shRNA细胞中过表达NF-κB,CD46、CD55和CD59蛋白表达水平明显回升(P<0.05)。结论:HBXIP可能通过介导NF-κB活性调节CD46、CD55、CD59表达参与肝癌细胞免疫逃逸,为肝癌临床治疗提供新靶点。

锌指蛋白A20对细胞内毒素性损伤的保护作用

锌指蛋白A20是上世纪90年代发现的一种内源性炎症调控蛋白,它依赖于核因子κB的活化,并能对NF-κB的表达进行负反馈调节,属于内源性的组织保护蛋白。随着近年来研究的不断深入,发现锌指蛋白A20对细胞内毒素性损伤起到了重要的修复作用。本文将对锌指蛋白A20的分子生物学特性,锌指蛋白A20对内毒素的抑制作用以及锌指蛋白A20对细胞内毒素性损伤的保护作用进行综述。

肝脏特异性敲除核因子-κB必需调节蛋白基因对Myc过表达诱导的小鼠原发性肝癌发生发展的影响

目的:探讨IκB激酶(IKK)/核因子-κB(NF-κB)信号通路对Myc过表达诱导的小鼠原发性肝癌发生发展的影响。方法:利用转基因小鼠将LAP-tTA小鼠与Alb-cre小鼠杂交,再与NEMO f1(NEMO为NF-κB必需调节蛋白)小鼠杂交,以产生LAP-tTA+/Alb-cre+/NEMO fl/wt小鼠,最后与tetO-Myc+小鼠杂交。本实验包括4组:(1)WT小鼠;(2)NEMOΔLPC小鼠(肝细胞中NEMO敲除,无Myc过表达);(3)Myc LAP-tTA小鼠(Myc过表达,无NEMO敲除);(4)Myc LAP-tTA/NEMOΔLPC小鼠(肝脏Myc过表达和NEMO敲除)。记录小鼠的生存曲线,观察肝脏大体形态。苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理结构,免疫组织化学染色、蛋白质印迹法(Western blot)检测肝脏肿瘤指标及肝祖细胞指标、定量聚合酶链反应(qPCR)方法检测相关蛋白的mRNA水平。使用t检验比较独立样本组与相应组。结果:小鼠带瘤生存曲线显示Myc LAP-tTA/NEMOΔLPC小鼠中位生存期明显短于Myc LAP-tTA小鼠(中位生存期M/P 5056 d比83 d,P<0.01);Myc LAP-tTA/NEMOΔLPC小鼠对比Myc LAP-tTA小鼠,谷草转氨酶[(739.40±35.61)U/L比(441.50±78.79)U/L,t=2.464,P<0.05]、碱性磷酸酶[(3142.0±287.6)U/L比(1702.0±278.8)U/L,t=3.129,P<0.01]、γ-谷氨酰基转移酶[(101.70±12.82)U/L比(37.31±9.34)U/L,t=3.927,P<0.01]和总胆红素[(1.281±0.232)mg/dl比(0.618±0.051)mg/dl,t=3.889,P<0.01]均显著升高,且差异有统计学意义;Western blot检测显示细胞角蛋白19(CK19)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)水平在Myc LAP-tTA/NEMOΔLPC较Myc LAP-tTA组小鼠肝脏亦明显升高;肝祖细胞标志物如角蛋白(CK19,4.336±1.970比0.680±0.234,t=1.843,P<0.01)、CK7(3.884±0.338比2.370±0.525,t=2.422,P<0.01)、甲胎蛋白(AFP,3614.0±2070.0比1399.0±319.9,t=1.057,P<0.01)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)的mRNA水平在Myc LAP-tTA/NEMOΔLPC较Myc LAP-tTA组小鼠肝脏显著增高(7.900±0.997比3.084±0.711,t=3.943,P<0.01)。结论:肝细胞中特异性敲除NEMO从而抑制经典的IKK/NF-κB信号通路,可促进肝肿瘤的发生发展,并诱导混合型肝细胞癌-胆管细胞癌的发生。白细胞介素(IL)-6/信号转导与转录激活因子-3(STAT3)通路与细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路可能参与混合型肝癌的发生发展。

SIRT6、MMPs与胎膜早破的相关性研究

胎膜早破(PROM)指的是孕妇在临产前胎膜出现的自发性破裂,是产科常见的并发症之一。已知胎膜的抗张力作用/拉伸强度主要由羊膜细胞外基质(ECM)中的胶原含量决定的,而基质金属蛋白酶(MMPs)是降解ECM成分的强效酶家族,在炎性因子的作用下可使其在胎膜组织中的表达含量增加,从而导致局部胎膜变薄弱甚至PROM的发生。SIRT6是一种NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶,可使NF-κB的RelA亚单位去乙酰化,抑制其目标启动子,抑制细胞凋亡和细胞衰老,其也可通过共价修饰参与炎症反应、氧化应激等在内的细胞内生理活动,且可通过调控MMPs表达水平来影响胎膜的完整性,进而致使PROM的发生。本文就SIRT6、MMPs与PROM的相关性进行综述,期望对PROM的发生机制以及防治有更进一步的认识。