猪IFN-β启动子及其NF-κB结合位点萤光素酶报告载体的构建与活性检测

通过PCR的方法从猪基因组DNA中克隆IFN-β基因启动子片段,分别构建了含有猪β干扰素基因启动子萤光素酶报告质粒及其4个重复的NF-κB结合位点序列的萤光素酶报告质粒。脂质体基因转染法将萤光素酶报告质粒转染PK-15细胞,在poly(I∶C)或poly(dAT∶dAT)的刺激下,萤光素酶表达显著增加。本试验为进一步探讨猪β干扰素信号转导通路的研究奠定了基础。

NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响

探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响。采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的重组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱。说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路。

NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用。方法以人基因组DNA为模板，PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列，以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构，将这段序列进行酶切并定向克隆人表达载体pEGFP-N3中，构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）载体，将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINE^TM 2000介导瞬时转染HeLa细胞，在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP。用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变，将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞，观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功，并且NF-κB结合位点突变成功。细胞转染结果表明，构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞，在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光，而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱，与未转染质粒相近。结论成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒；NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞中绿色荧光表达明显减弱，说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用；为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。