基于NF-κB通路研究平肝活血合剂对脑缺血再灌注损伤的作用机制

目的 探讨平肝活血合剂对脑缺血再灌注损伤(CIRI)的作用机制。方法 采用线栓法制备CIRI模型。SD大鼠随机分为假手术组,模型组,平肝活血合剂低、中、高剂量组(2.08、4.16、8.32 mL·kg^(-1)),阳性对照组(丁苯酞软胶囊6.25 mg·kg^(-1)),每组10只。灌胃治疗7d,每日1次。造模后第1、3、7日观察大鼠神经功能评分。给药7日后观察大鼠脑缺血组织病理改变,测定脑梗死体积百分比,检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)的水平,脑缺血组织中的TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA表达,脑缺血组织中磷酸化的NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)、核转录因子-κBp65(NF-κBp65)、磷酸化的核转录因子-κBp65(p-NF-κBp65)蛋白的表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠给药7日后Longa评分显著升高,右脑出现鲜明的苍白色梗死灶(P <0.01),TNF-α、IL-1β、IL-8及TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA表达均显著上升,p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表达均明显上调(P <0.05或P <0.01)。HE染色显示脑缺血组织区网状结构疏松,细胞错乱、结构缺损甚至萎缩变形、数量变少,核固缩及碎裂。与模型组比较,给药7日后平肝活血合剂各剂量组Longa评分显著降低,其余检测指标亦明显下降(P <0.05或P <0.01)。结论 平肝活血合剂可显著改善CIRI的炎症因子水平,减轻脑损伤,其机制可能与调控NF-κB信号通路有关。

当归芍药散联合TLR4抑制剂对大鼠肝纤维化的抑制作用及NF-κB/NLRP3通路的调节作用研究

目的研究当归芍药散联合Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)抑制剂对大鼠肝纤维化的抑制作用及对核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)通路的调节作用。方法大鼠随机分为空白对照组及造模组,造模组采用腹腔注射四氯化碳(CCl_(4))法建立肝纤维化大鼠模型,造模完成后的大鼠随机分为肝纤维化模型组、当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组,12只/组,当归芍药散组大鼠按照10 g·kg^(-1)(以生药含量计)灌胃给予大鼠当归芍药散,TLR4抑制剂组腹腔注射给予大鼠TAK-242(3 mg·kg^(-1)),联合组同时给予大鼠当归芍药散(10 g·kg^(-1))及TAK-242(3 mg·kg^(-1)),1次/天,连续给药13周,测定大鼠体质量、肝脏重量及肝脏指数,使用全自动生化分析仪测定大鼠血清直接胆红素(Direct bilirubin,DBIL)、总胆汁酸(Total bile acid,TBA)及总胆红素(Total bilirubin,TBIL)水平,使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肝组织细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)及还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平,Masson染色法检查大鼠肝组织病理学变化,实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Rt-qPCR)测定肝组织NLPR3及NF-κB mRNA水平,免疫印迹法(Western blot)测定肝组织NLPR3及NF-κB蛋白水平,免疫荧光法测定肝组织α-SMA表达。结果与空白对照组比较,肝纤维化模型组大鼠肝脏质量、肝脏指数,血清DBIL、TBA及TBIL水平、肝组织ICAM-1及MDA水平、肝组织NLPR3及NF-κB mRNA及蛋白水平、肝组织α-SMA免疫荧光强度显著升高(P<0.05),体质量、肝组织SOD及GSH水平显著降低(P<0.05),肝组织明显纤维化改变;与肝纤维化模型组比较,当归芍药散组、TLR4抑制剂组及联合组大鼠肝脏质量、肝脏指数,血清DBIL、TBA及TBIL水平、肝组织ICAM-1及MDA水平、肝组织NLPR3及NF-κB mRNA及蛋白水平、肝组织α-SMA免疫荧光强度显著降低(P<0.05),体质量、肝组织SOD及GSH水平显著升高(P<0.05),肝组织病理学明显恢复,且联合组各项指标变化显著优于当归芍药散及TLR4抑制剂单独给药组。结论当归芍药散联合TLR4抑制剂能显著改善肝纤维化大鼠肝功能,抑制肝组织纤维化进展,降低氧化应激损伤,其机制可能与调节NF-κB/NLPR3通路有关。

二甲双胍通过抑制IL-6/NF-κB/P-gp改善卵巢癌PARP抑制剂耐药

目的:探讨二甲双胍对同源重组修复功能缺陷(HRD)阳性PARP抑制剂(PARPi)耐药卵巢癌的作用及相关机制。方法:逐步诱导法建立尼拉帕利耐药的HRD阳性SKOV3卵巢癌细胞系(SKOV3/PARPi)。白细胞介素-6(IL-6)、转染si-IL-6 RNA以及二甲双胍作用后,采用CCK-8法检测SKOV3或SKOV3/PARPi细胞增殖的变化,Western blot检测细胞内IL-6及P糖蛋白(P-gp)水平、AKT及NF-κB活性的变化,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-6含量的变化。建立SKOV3/PARPi卵巢癌裸鼠荷瘤模型并验证二甲双胍、PARPi处理对瘤体的影响,免疫组化及Western blot检测瘤组织内P-gp蛋白的表达。结果:100μg/L IL-6作用SKOV3细胞后尼拉帕利的IC_(50)上调(P<0.001),细胞内P-gp表达增加(P<0.001)。SKOV3/PARPi细胞转染si-IL-6 RNA后尼拉帕利的IC_(50)下调(P=0.008),P-gp表达降低(P<0.001)。二甲双胍作用SKOV3/PARPi细胞后,尼拉帕利的IC_(50)下调(P<0.001);细胞内IL-6及P-gp蛋白水平、AKT及NF-κB活性均下降(P<0.001)。二甲双胍可改善SKOV3/PARPi荷瘤裸鼠尼拉帕利耐药,下调瘤组织内P-gp表达(P均<0.05)。结论:二甲双胍可通过抑制IL-6/NF-κB/P-gp改善卵巢癌PARPi耐药。

PI3K抑制剂林普利塞对弥漫大B细胞淋巴瘤的体外抗肿瘤效应

目的探讨PI3K抑制剂林普利塞(Linperlisib,YY-20394)对弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)的抗肿瘤效应及其作用机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度YY-20394对SU-DHL-4细胞(GCB亚型)和U2932细胞(ABC亚型)增殖能力的影响,并计算出24 h时药物的IC_(25)、IC_(50)、IC_(75)。采用流式细胞术检测IC_(25)、IC_(50)和IC_(75)浓度YY-20394对SU-DHL-4细胞和U2932细胞凋亡的影响。采用高通量RNA测序技术(RNA-Seq)检测药物作用前后各组细胞基因表达的变化,对差异表达基因进行KEGG信号通路分析和GO富集分析,并且对各组细胞基因表达数据进行GSEA富集分析。结果在YY-20394作用下,SU-DHL-4细胞增殖抑制率和细胞凋亡率增加(P<0.05),但U2932细胞增殖及凋亡能力未发生明显改变(P>0.05)。KEGG和GO富集分析结果显示,YY-20394对SU-DHL-4细胞的抗肿瘤作用涉及多条信号通路,其中PI3K-AKT、MAPK、JAK-STAT等信号通路的活性下调,且可能通过影响醇类物质合成等细胞生物学功能发挥作用;而U2932细胞中未富集到具有显著差异的信号通路。GSEA富集分析显示PI3K-AKT信号通路在SU-DHL-4细胞中的活化水平显著低于U2932细胞。结论PI3K抑制剂YY-20394通过影响PI3K-AKT等肿瘤相关信号通路,对GCB亚型的SU-DHL-4细胞产生抗肿瘤效应,而对ABC亚型的U2932细胞不敏感。

NF-κB信号通路与肝纤维化的研究进展

核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一类广泛存在的、调控着多种基因转录的重要转录调节因子。NF-κB是细胞中重要的转录调节因子,通常以p50-p65异二聚体的形式与其抑制性蛋白结合而呈非活化状态。NF-κB的不适当表达和激活与各种疾病的发生密切相关。因此,以NF-κB为治疗靶点的药物研究可能为预防和治疗这些疾病提供新思路。本文就NF-κB信号通路与肝纤维化发生、发展及其与肝星形细胞之间关系的研究进展做一综述。

BTK抑制剂GDC-0853通过TLR4/NF-κB通路抑制M1巨噬细胞极化并改善UUO肾损伤

目的探究BTK抑制剂GDC-0853对巨噬细胞极化的影响、对小鼠单侧输尿管梗阻(unilated ureteral obstruction,UUO)肾损伤的缓解作用并揭示其相关的机制。方法使用不同浓度BTK抑制剂GDC-0853(20、50、100μmol/L)干预LPS+IFNγ诱导RAW264.7小鼠M0型巨噬细胞向M1型极化,流式细胞术检测巨噬细胞M1型标记物CD86与M2型标记物CD206的表达频率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-23(IL-23)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA水平,Western blot法检测CD86、iNOS蛋白表达以及TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达情况;60只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(sham)、UUO组、UUO+BTK抑制剂GDC-0853(低、中、高剂量)组,分别予以生理盐水和20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg GDC-0853灌胃预处理3 d,UUO术后再处理7 d后取小鼠肾组织,HE染色观察肾组织病理变化,免疫组化染色检测iNOS阳性表达。结果与LPS+IFNγ组比较,不同浓度BTK抑制剂GDC-0853干预后,M1型巨噬细胞标记物CD86百分比下降而M2型巨噬细胞标记物CD206百分比上升,TNF-α、IL-6、IL-23、iNOS mRNA表达水平以及CD86、iNOS、TLR4、p-IκBα、p-P65蛋白表达水平也显著下降,且呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.01)。BTK抑制剂GDC-0853处理的小鼠肾组织病理损伤较UUO组呈剂量依赖性地减轻,同时,iNOS阳性表达较UUO组也呈剂量依赖性地减弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论BTK抑制剂GDC-0853可改善小鼠UUO的肾损伤,可能是通过介导TLR4/NF-κB信号通路调控巨噬细胞M1的极化来实现的。

蛋白酶体抑制剂YSY01A不依赖NF-κB通路抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡研究

目的研究YSY01A对乳腺癌的增殖抑制作用及其抗癌机制。方法荧光底物法检测蛋白酶体活性;蛋白酶体荧光探针法研究YSY01A与蛋白酶体β催化亚基结合;Annexin V-FITC、JC-1探针检测YSY01A对细胞凋亡和线粒体膜电位的影响;用蛋白免疫印迹法检测细胞内的蛋白表达。结果YSY01A抑制细胞内外蛋白酶体的活性,其中对CT-L的抑制作用最强,对T-L的作用比PS341强3-4倍;MCF-7对YSY01A最敏感,且比PS341敏感性高;YSY01A以时间依赖性诱导细胞凋亡,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05)。YSY01A增加ubiquitin、P-IκBα、wt-p53、Bax、endonuclearse G蛋白表达,减少IκBα、Bcl-xL、XIAP水平,不影响NF-κB表达。结论 YSY01A是新蛋白酶体抑制剂,具有较强的抑制MCF-7细胞增殖的作用,抗癌机制与诱导细胞凋亡有关。

蛋白酶体抑制剂依沙佐米对胰腺癌细胞凋亡及NF-κB通路的影响

目的:探讨蛋白酶抑制剂依沙佐米对胰腺癌细胞凋亡和NF-κB通路的影响。方法:培养人胰腺癌细胞系CFPAC-1和PANC-1,加入浓度为0、10、20、30和40 nmol/L的依沙佐米培养12、18、24和48 h,RT-qPCR检测细胞中NF-κB p65、IκB激酶(IκB kinase, IKK)、Bax和caspase-3的mRNA表达,Western blot检测细胞中凋亡相关因子NF-κB p65、IKK、Bax和caspase3的蛋白水平,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:CCK-8实验的检测结果显示,添加10~40 nmol/L依沙佐米均对PANC-1细胞和CFPAC-1细胞的活力具有抑制作用(P<0.05),呈时间和剂量依赖性;细胞凋亡检测结果显示随着依沙佐米浓度的增加,PANC-1细胞和CFPAC-1细胞的凋亡率均显著增加(P<0.05);与添加0 nmol/L抑制剂的对照细胞比较添加依沙佐米后PANC-1细胞和CFPAC-1细胞NF-κB p65和IKK的mRNA表达水平显著降低(P<0.05);凋亡因子Bax和caspase-3的表达水平均显著升高(P<0.05)。添加依沙佐米后PANC-1细胞和CFPAC-1细胞的NF-κB p65和IKK的蛋白水平均显著降低(P<0.05),与mRNA检测结果一致;CFPAC-1细胞的凋亡因子Bax和caspase-3蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),PANC-1细胞的caspase-3蛋白表达水平显著升高,Bax蛋白在依沙佐米为10 nmol/L浓度时变化的差异无统计学显著性。结论:蛋白酶体抑制剂依沙佐米可能通过抑制NF-κB通路的激活抑制胰腺癌细胞的活力,促进细胞凋亡,且作用效果呈时间和剂量依赖性。

HMGB1抑制剂预处理对大鼠心肺复苏后脑缺血再灌注损伤及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)抑制剂预处理对大鼠心肺复苏后脑缺血再灌注损伤及Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法建立大鼠心肺复苏模型(封闭气管3~4 min),随机分为模型组,甘草酸(HMGB1抑制剂)低、中、高剂量组(分别以1、2、3 mg/mL甘草酸溶液按体重10 mL/kg灌胃),以及乌司他丁组(按体重以50000 U/kg尾静脉注射乌司他丁),每组各12只;另设假手术组12只(仅暴露气管但不封闭气管)。观察各组神经功能缺损评分,测量计算各组大鼠脑组织含水量;采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠神经元受损情况;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中枢神经特异性蛋白(S100β)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平,以及脑组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot法检测脑组织TLR4/NF-κB通路蛋白TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、NF-κB p65、磷酸化核转录因子-κB(p-NF-κB p65)表达情况。结果与假手术组相比,模型组大鼠脑组织神经元核皱缩、变性,神经元损伤,脑组织含水量、神经功能缺损评分、血清中S100β及NSE水平、脑组织IL-6及TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,甘草酸低、中、高剂量组、乌司他丁组大鼠脑组织神经元恢复,神经功能缺损评分、脑组织含水量、血清中S100β、NSE水平、脑组织IL-6及TNF-α、TLR4、MyD88及NF-κB p65表达均降低(P<0.05),且甘草酸各剂量组间随剂量增高而降低。甘草酸高剂量组与乌司他丁组相比,上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论HMGB1抑制剂甘草酸可能对心肺复苏后大鼠脑缺血再灌注损伤有修复作用,其作用可能是通过下调TLR4/NF-κB通路实现的。

新型冠状病毒非结构蛋白NSP13通过调控IκBα蛋白降解抑制NF-κB信号通路

目的研究新型冠状病毒非结构蛋白13(NSP13)调控NF-κB信号通路的作用机制。方法利用GV367-NSP13-FLAG慢病毒感染的方法制备高表达NSP13的A549细胞(A549-NSP13)和A549对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA检测NF-κB下游细胞因子白细胞介素6(IL-6)和趋化因子5(CCL-5)表达水平;Western印迹法检测NF-κB信号通路P65、磷酸化P65和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白表达。放线菌酮10 mg·L^(-1)处理细胞0,15,30,45,90和120 min,Western印迹法检测IκBα蛋白半衰期。结果与A549对照组相比,A549-NSP13细胞检测到FLAG标签蛋白条带,且NSP13 mRNA表达显著上调(P<0.01),表明A549-NSP13细胞系构建成功。与A549对照组相比,A549-NSP13细胞IL-6 mRNA和蛋白表达水平(P<0.01)及CCL-5 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)均显著降低;磷酸化P65蛋白表达下降(P<0.01),而IκBα蛋白表达上调(P<0.01);且IκBα蛋白半衰期增加(P<0.01)。结论NSP13蛋白可通过抑制IκBα降解进而抑制NF-κB信号通路的活化并降低其下游IL-6和CCL-5等炎症相关分子产生和分泌。

通路抑制剂对Tax诱导的Bcl-3的影响及其在NF-κB激活中作用的研究

目的:通过研究不同通路的抑制剂在TaxP细胞(稳定表达Tax的Jurkat亚细胞系)中对Bcl-3(Human B-cellleukemia protein 3)表达的影响和shRNA Bcl-3对NF-κB转录激活作用的影响,探讨Tax阳性细胞中调控Bcl-3的通路及Bcl-3在NF-κB通路中的作用。方法:将TaxP细胞分别用NF-κB(Nuclear factor-κB)抑制剂、GSK(Glycogen synthase kinase)抑制剂和蛋白酶抑制剂处理后,Western blot检测Bcl-3蛋白的表达情况;将Bcl-3的shRNA质粒转入TaxP细胞中,RT-PCR检测Bcl-3mRNA的表达抑制情况;共转染Bcl-3的shRNA和pNF-κB-luc质粒至Jurkat和TaxP细胞中,检测抑制Bcl-3表达后对NF-κB转录活性的影响。结果:Bcl-3的表达不受GSK抑制剂的影响,但在蛋白酶抑制后有明显的升高;RT-PCR的结果表明,在转染Bcl-3 shRNA质粒后,Bcl-3的mRNA表达有明显的下降,荧光素酶活性结果显示Bcl-3在Jurkat和TaxP细胞中被抑制后NF-κB的转录活性明显下降(P<0.05)。结论:Tax诱导的Bcl-3表达不依赖于GSK通路,而NF-κB通路参与了Bcl-3的调控,说明Bcl-3在NF-κB的激活中发挥着促进作用。

NF-κB信号通路激活剂LPS/抑制剂SN50对鸭肠炎病毒增殖影响的研究

为探究NF-κB信号通路对鸭肠炎病毒(DEV)增殖的影响,本实验分别以不同终浓度的NF-κB信号通路激活剂LPS(2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)和抑制剂SN50(25.0μg/mL、50.0μg/mL、75.0μg/mL)处理鸭胚成纤维(DEF)细胞后,采用CCK8法分析LPS或SN50对DEF细胞活性影响;利用不同浓度的LPS或SN50预处理DEF细胞4 h后,再于12 h120 h后收获细胞和上清液(未感染DEV);上述经LPS或SN50预处理细胞4 h后接种DEV(MOI 0.01),12 h120 h后(每间隔12 h)分别收获细胞及上清液,采用荧光定量PCR方法分别检测上述未感染和感染DEV的DEF细胞中NF-κB1基因和DEV NP基因的转录水平;采用ELISA方法分别检测上述未感染和感染DEV的DEF细胞上清液中NF-κB信号通路关键因子(IL-1β、IL-6和MyD88)的表达水平。结果显示:不同浓度的LPS和SN50处理对DEF细胞均无明显毒性作用。荧光定量PCR结果显示,经不同浓度LPS预处理,均能有效提高DEF细胞中NF-κB1基因的转录水平,其中4.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因转录水平最高;而在LPS预处理再感染DEV后,4.0μg/mL LPS和6.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因转录水平整体上调(p<0.05),2.0μg/mL LPS处理的DEF细胞中NF-κB1基因的转录水平整体下调(p<0.05);不同浓度的SN50预处理后,未感染和感染DEV的DEF细胞中,均以50.0μg/mL SN50处理的细胞中NF-κB1基因的转录水平下调效果最好(p<0.05)。LPS预处理DEF细胞后感染DEV,12h84 h DEV NP基因的转录水平均受到明显抑制(p<0.01),84 h后2.0μg/mL和6.0μg/mL LPS均会促进DEV NP基因的转录水平;而经SN50预处理DEF细胞后感染DEV,细胞中DEV NP基因的转录水平均显著下降(p<0.01)。ELISA结果显示,经LPS预处理后,不感染或感染DEV,DEF细胞中IL-6表达量整体稍呈下降趋势(p>0.05),而IL-1β和MyD88的表达则呈无规律变化;经SN50预处理后不感染或感染DEV,DEF细胞中IL-1β、IL-6和MyD88的表达均无规律变化。以上研究结果表明,不同浓度LPS均可促进正常DEF细胞中NF-κB1基因的转录,而DEV则可以阻断低浓度LPS(2.0μg/mL)的这种促进作用。不感染或感染DEV,SN50均于高浓度(50μg/mL和75μg/mL)时才能有效降低NF-κB1基因的转录水平;不同浓度的LPS或SN50均对NF-κB通路关键因子的表达基本无影响;LPS在DEV感染后期才能促进其增殖,而SN50则可以有效抑制DEV的增殖。本研究为阐明NF-κB信号通路与DEV之间的相互作用关系奠定了实验基础。。

Yap抑制剂抑制NF-κB/MMP-9信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡的实验研究

目的:探讨Yap抑制剂抑制NF-κB/MMP-9信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡的研究。方法:对Control(结直肠癌细胞株SW480)、Yap mimics(结直肠癌细胞株+Yap促进)和Yap Inhibitor(结直肠癌细胞株+VGLL4)进行转染、通过qPCR、免疫印记、Western-blot、流式细胞检测Yap、NF-κB和MMP-9水平、E-cadherin和vimentin mRNA、细胞的凋亡情况。结果:Yap在结肠癌细胞株属于高表达,Control中的NF-κB和MMP-9表达水平显著低于Yap mimics(P<0.05),Yap mimics中的NF-κB和MMP-9表达水平明显高于Yap Inhibitor(P<0.05),与Control相比,Yap Inhibitor中的NF-κB和MMP-9表达明显降低(P<0.05);Control中的E-cadherin mRNA显著低于Yap mimics(P<0.05),Yap mimics中的E-cadherin mRNA明显高于Yap Inhibitor(P<0.05);Control中的vimentin mRNA显著高于Yap mimics(P<0.05);Yap Inhibitor结直肠癌细胞凋亡数量与Control和Yap mimics相比凋亡最多(P<0.05),与Control相比,Yap mimics结直肠癌细胞凋亡数量最少(P<0.05)。结论:Yap抑制剂通过阻碍NF-κB/MMP-9信号通路的发展,促进结肠癌细胞的凋亡,抑制细胞增殖,阻止结直肠癌继续发展。

蒽贝素(Embelin)通过阻断NF-κB信号通路抑制肝癌细胞Bel-7404生长的研究

蒽贝素(Embelin)是一种X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的小分子抑制剂,可以抑制XIAP的生成和活性,从而解除XIAP的抗凋亡作用,使凋亡顺利进行.研究了Embelin抑制肝癌细胞Bel-7404增殖的机制.采用不同浓度梯度,通过荧光显微镜、Hochest33342染色、MTT检测、AnnexinⅤ/PI流式细胞术和Western blot分别检测Embelin对Bel-7404细胞的形态学变化、凋亡小体形成、细胞存活率、细胞凋亡水平、凋亡信号转导相关蛋白表达的影响.结果显示,Embelin能明显抑制Bel-7404细胞增殖,并通过激活caspase通路以及阻断NF-κB信号通路诱导Bel-7404细胞凋亡,为进一步利用Embelin进行肝癌治疗的研究打下一定的基础.

NF-κB抑制剂PDTC抗白血病细胞增殖的实验研究

目的:观察核转录因子NF-κB活性特异性抑制剂PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)对急性白血病细胞系K562细胞增殖的影响,并探讨其机制。方法:利用Trans AMTM NF-κB/p65活性测定试剂盒,检测PDTC作用K562细胞12h、24h后NF-κB亚基p65活性的变化;采用WST-1细胞增殖试验观察不同浓度PDTC作用24h、48h、72h对细胞增殖的影响;用单细胞凝胶电泳(彗星检测)方法检测PDTC对K562细胞DNA损伤的影响;利用免疫印迹法(Western blotting)检测PDTC对K562细胞中pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白表达的影响。结果:与对照组相比,经PDTC处理的实验组K562细胞NF-κB/P65的活性受到明显抑制(P<0.01);且PDTC能以时间和剂量依赖方式抑制K562细胞的增殖(P<0.05);单细胞凝胶电泳显示实验组细胞DNA受损,浓度为25μmol/L、50μmol/L、100μmol/LPDTC处理后,实验组细胞DNA总损伤细胞百分率分别为43.50%、84.00%、95.63%,明显高于对照组(9.75%),P<0.05,且存在明显的剂量依赖关系;Western blotting结果显示经PDTC处理后的K562细胞胞质中可检测到pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白的表达。结论:NF-κB参与白血病细胞的增殖与凋亡调控,PDTC抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB活性,上调caspase-3表达,从而诱导细胞凋亡有关。

拓扑异构酶抑制剂通过ATM/ATR和NF-κB途径上调乳腺癌细胞MICA/B的表达

目的:分析常用化疗药物对免疫识别乳腺癌细胞重要的靶标主要组织相容性复合体Ⅰ类相关分子A和B(major histocompatibility complex classⅠ-related chain A and B,MICA/B)的影响,探讨其调节MICA/B表达的分子机制。方法:用荧光定量RT-PCR法检测化疗药物对乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA表达的影响,流式细胞术检测化疗药物对MICA/B表面蛋白表达的作用。加入咖啡因抑制毛细血管扩张性共济失调突变和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related kinase,ATM/ATR),加入吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pynolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB),观察其是否能够抑制化疗药物中拓扑异构酶抑制剂对乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA及蛋白的表达。凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测药物是否影响乳腺癌细胞NF-κB与MICA/B启动子区的结合。结果:三种拓扑异构酶抑制剂足叶乙甙、拓扑替康和阿霉素可使乳腺癌MCF-7细胞的MICA和MICB mRNA水平升高。足叶乙甙在浓度为5、20、100μmol/L时,与不加药处理组相比,MICA mRNA水平分别升高到(1.68±0.17)、(2.54±0.25)、(3.42±0.15)倍(P<0.05);MICB mRNA水平分别升高到(1.82±0.24)、(1.56±0.05)、(5.84±0.57)倍(P<0.05)。拓扑替康和阿霉素在特定浓度时也使MCF-7的MICA和MICB mRNA水平显著升高(P<0.05)。拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙甙和拓扑替康处理另一乳腺癌细胞系SK-BR-3后,MICB mRNA的表达也轻度升高(P<0.05)。足叶乙甙和拓扑替康还增加MCF-7细胞表面MICA/B蛋白的表达(P<0.05),且存活和凋亡细胞MICA/B蛋白的表达均增高。用不同浓度的咖啡因处理足叶乙甙损伤的乳腺癌细胞,MICA/B mRNA和蛋白表达均显著降低,当咖啡因浓度为1、5、10 mmol/L时,MICA mRNA相对表达水平由不用咖啡因处理组的(3.75±0.25)倍分别降为(0.89±0.05)、(0.81±0.02)、(0.48±0.04)倍(P<0.001),MICB mRNA由(6.85±0.35)倍降为(1.36±0.13)、(0.76±0.06)、(0.56±0.03)倍(P<0.05),MICA/B蛋白表达由(3.42±0.05)倍降为(1.32±0.03)、(1.21±0.06)、(1.14±0.03)倍(P<0.001),表明足叶乙甙对MICA/B的上调作用能够被ATM/ATR抑制剂所抑制。同样,加入不同浓度的NF-κB的强抑制剂PDTC(10、50、100μmol/L),MICA/B mRNA和蛋白的表达均明显受到抑制(P<0.05),提示NF-κB也参与这一过程。EMSA实验显示,MCF-7细胞用足叶乙甙处理后,NF-κB与MICA/B基因启动子区的结合活性增强。结论:拓扑异构酶抑制剂诱导并上调乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA及表面蛋白的表达,表明化疗药物有可能增强免疫系统对乳腺癌的识别和杀伤,ATM/ATR和NF-κB途径参与了这一过程。

NF-κB抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)对角膜移植大鼠角膜组织的影响

目的探讨核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对角膜移植大鼠角膜组织的影响。方法取14只Wistar大鼠为供体鼠,提供双眼角膜; 28只SD大鼠为受体鼠,均以左眼为术眼,右眼设为正常对照,在显微镜下进行同种异体角膜移植术。手术完成后将28只SD大鼠随机分为3组,对照组(10只)以生理盐水滴左眼,实验组(10只)以1 mg·mL^(-1)PDTC滴左眼,均为每天3次,每次1滴,空白组(8只)不做任何处理。术后第1天起,每组分别在术后第5天、第15天、第25天在裂隙灯下观察角膜新生血管的情况并进行评分。对各组角膜植片进行病理学及免疫组织化学染色观察,分析各组大鼠NF-κB及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在角膜植片的表达情况。结果对照组、实验组、空白组角膜移植排斥反应发生的时间分别为(10. 80±1. 40) d、(23. 40±2. 30) d、(11. 20±2. 06) d,实验组排斥反应发生的时间较对照组明显延长,差异有统计学意义(P <0. 01)。对照组新生血管一般术后第3～5天出现,并很快进入植片周边,沿缝线处向角膜植片中央粗大生长。实验组新生血管一般术后第5～7天出现,生长速度较慢,血管稀疏。术后不同时间实验组新生血管数、新生血管面积及排斥反应指数均小于对照组,差异均有统计学意义(P <0. 05)。角膜移植术后,实验组大鼠角膜上皮基底细胞内出现较多空泡,角膜基质层内出现间质水肿;炎症细胞浸润,并见新生的毛细血管;缝线及切口周围见大量淋巴细胞浸润,部分植片中央发生散在的炎症细胞浸润、角膜上皮部分脱落。对照组角膜植片水肿及炎症细胞的浸润程度较实验组明显增加,且对照组角膜植片显著增厚,基质结构疏松、紊乱;实验组角膜植片相对基质板层结构排列有序,新生血管数在相同时间内明显减少。免疫组织化学染色显示,NF-κB阳性细胞数,实验组为每400倍视野(4. 236±0. 856)个,较对照组[(18. 451±1. 234)个]明显减少,差异有统计学意义(P <0. 05);空白组大鼠角膜内鲜有阳性表达。VEGF阳性细胞数,实验组为每400倍视野(2. 631±0. 238)个,较对照组[(6. 254±0. 721)个]明显减少,差异有统计学意义(P <0. 05);空白组大鼠角膜内鲜有阳性表达。结论大鼠进行同种异体角膜移植术后,NF-κB抑制剂PDTC可在一定程度上减少角膜新生血管的生成,抑制角膜移植排斥反应的发生。

NF-κB抑制剂对THP-1粘附及MMP-9表达影响的实验研究

前单核细胞 THP- 1分化是一个复杂的过程 ,这一过程包含了复杂的细胞内信号传导及许多因子的活化及大量蛋白的表达。基质金属蛋白酶 - 9(Motrix Metalloproteinase- 9,MMP- 9)主要降解基底膜中的 和 型胶原 ,在血管增生及肿瘤浸润转移过程中起重要的作用。为探讨核转录因子 κB(nuclear factor kappaB,NF- κB)在 THP- 1粘附及 MMP- 9表达中的作用 ,我们应用 NF- κB抑制剂 PDTC(Pyrollidine Dithiocarba-mate二硫碳吡咯烷 ,应用共聚焦显微镜、流式细胞术观测了其对 THP- 1粘附及 MMP- 9表达的影响。结果表现 :PDTC可明显的抑制 THP- 1的粘附及 MMP- 9的表达。表明 NF- κB在细胞粘附及 MMP- 9的表达中起重要的作用。

癌症治疗中PI3K/AKT/mTOR通路及靶向抑制剂研究进展

目的为磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路抑制剂的开发、临床应用提供参考。方法归纳PI3K/AKT/mTOR通路在多类型癌症进展中的作用,比较该通路靶向抑制剂的治疗作用。结果PI3K/AKT/mTOR通路可促进肿瘤细胞增殖、迁移,促进耐药性产生。该通路抑制剂有PI3K靶向抑制剂、AKT靶向抑制剂、mTOR靶向抑制剂和PI3K/mTOR双靶向抑制剂,可延长患者的生存期,具有一定的肿瘤抑制作用。其中,PI3K和mTOR靶向抑制剂较AKT靶向抑制剂发展相对较好,多用于乳腺癌的治疗、延缓耐药性产生等。结论PI3K/AKT/mTOR通路促进癌症发展,其靶向抑制剂具有良好的靶向抗肿瘤效果,但应进一步增强特异性和选择性,减少不良反应。