角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜发病中的作用

背景 氧化应激在圆锥角膜发病过程中具有重要的作用,核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）信号通路是介导细胞氧化应激反应的关键通路,但其在圆锥角膜发病中的作用及其机制鲜见报道. 目的 研究正常角膜与圆锥角膜基质细胞中Nrf2-ARE信号通路活化的区别及Nrf2-ARE通路对角膜基质降解酶表达水平的影响,探讨圆锥角膜发病的具体机制.方法 于2012年11月至2013年6月在青岛眼科医院收集圆锥角膜患者术中的角膜组织样本和正常供体角膜样本,采用中性蛋白酶和胶原蛋白酶联合消化法分离角膜基质细胞并用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞80％融合后在培养基中加入200 μmol/L H2O2处理1h以模拟氧化应激微环境.采用DCFH-DA荧光底物孵育法检测细胞内活性氧簇（ROS）含量,分别采用Western blot和实时定量PCR法检测细胞核内Nrf2mRNA及其蛋白、Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、uPA受体（uPAR） mRNA及其蛋白的相对表达水平,采用明胶酶谱法检测细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性.结果 正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强于正常角膜基质细胞,细胞核内Nrf2蛋白表达水平均明显高于正常角膜基质细胞,差异有统计学意义（t=18.155,P＜0.01）,但在H2O2处理条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强度明显强于正常角膜基质细胞,且圆锥角膜基质细胞核内Nrf2表达水平明显低于正常培养条件下的圆锥角膜基质细胞,差异有统计学意义（t=62.123,P＜0.01）.正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞间还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化还原酶1（NQO-1）、血红素氧合酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2） mRNA及其蛋白的相对表达量明显低于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;但在H2O2培养条件下2种细胞间未见明显变化（NQO-1：t=2.209,P=0.092;HO-1：t=0.293,P=0.784;SOD2：t=0.749,P=0.495）;圆锥角膜基质细胞uPA、uPAR表达量和MMP-2活性均明显高于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义（t=19.164、15.458、4.818,均P＜0.01）. 结论 圆锥角膜基质细胞在Nrf2-ARE信号通路活化方面存在缺陷,且这种缺陷与其表达基质降解酶的水平密切相关,说明该通路异常可能是圆锥角膜发病的机制之一.

Nrf2-Keap1-ARE信号通路与肿瘤耐药相关性

肿瘤耐药是影响肿瘤化学治疗的主要问题。肿瘤细胞产生耐药的机制及如何逆转耐药是亟待解决的重要问题。已知肿瘤耐药机制包括:肿瘤细胞内药物泵出增多、体内非特异解毒过程加强、DNA损伤修复能力增强、细胞凋亡抑制等。但主导机制或者说关键基因还是困扰耐药研究的主要难题。新近研究发现,以NF-E2相关因子2(Nrf2)为主体的该信号通路可能与多种耐药机制相关联,从而解释多种肿瘤耐药的原因。简述Nrf2-Keap1-ARE信号通路的组成及其与肿瘤耐药的相关性研究。

银杏叶提取物通过激活Nrf2-ARE信号通路对帕金森病大鼠发挥脑保护作用

目的观察银杏叶提取物对帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠模型黑质多巴胺能神经元中氧化应激参数及抗氧化通路转录因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件(transcription factor NF-E2-related factor-antioxident response element,Nrf2-ARE)的表达调控。方法 3月龄雄性SD大鼠75只随机分为对照组、模型组、阳性药组、受试药低剂量组和高剂量组,背部皮下注射鱼藤酮制备PD大鼠模型,低剂量组和高剂量组同时给予银杏叶提取物灌胃共30 d,同时设置美多芭灌胃为阳性药组。免疫组化观察中脑黑质多巴胺能神经元的数量,判断模型的制备效果;分光光度法检测大鼠脑内纹状体中氧化应激参数——丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量变化,采用Western blot免疫印迹法检测大鼠中脑黑质中酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、转录因子NF-E2相关因子(transcription factor NF-E2-related factor,Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的表达改变。结果与对照组相比,实验组大鼠纹状体中MDA增高了64.09%(P<0.01),GSH降低了40.69%(P<0.01),银杏叶提取物治疗后明显逆转了上述氧化应激状态。模型组大鼠中脑多巴胺能神经元中TH、Nrf2和HO-1蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05);银杏叶提取物治疗后与实验组相比T1H、Nrf2和HO-1蛋白表达明显增加(P<0.05)。同时我们发现上述改变有随着银杏叶提取物剂量增加而增强的趋势。结论银杏叶提取物能通过激活脑内的内源性Nrf2-ARE通路,改善氧化应激状态,保护脑内黑质多巴胺能神经元,为PD的临床治疗提供新的靶点。

外源性硫化氢通过Nrf2/ARE/HO-1通路对精神分裂症大鼠认知功能及肠道屏障功能的影响

目的探讨外源性硫化氢(H2S)通过核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)/血红素氧化酶1(HO-1)通路对精神分裂症大鼠认知功能及肠道屏障功能的影响。方法 40只SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、H2S干预组(腹腔注射10 mg/kg的H2S供体GYY4137)、Nrf2抑制剂组(腹腔注射10 mg/kg的Nrf2抑制剂ATRA)、H2S+Nrf2抑制剂组(腹腔注射GYY4137和ATRA),每组8只。除对照组外,其余各组通过腹腔注射0.2 mg/kg的MK-801构建精神分裂症大鼠模型,模型构建成功后按照各组给药方式进行干预,模型组和对照组以生理盐水替代,连续干预7 d。Morris水迷宫实验测定大鼠的认知功能;HE染色观察大鼠海马组织及肠组织病理学变化;TUNEL检测大鼠肠黏膜细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定大鼠血浆中H2S、D-乳酸含量及肠组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平;Western blot检测大鼠肠组织凋亡、Nrf2/ARE/HO-1通路相关蛋白表达情况。结果与对照组相比,模型组大鼠海马组织、肠组织损伤加重,逃避潜伏期、血浆D-乳酸、肠黏膜细胞凋亡率、肠组织Caspase-3、Bax蛋白、MDA、TNF-α、IL-6、Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05),穿台次数、血浆H2S水平、小肠绒毛高度、隐窝深度、肠组织Bcl-2蛋白、SOD水平降低(P<0.05);与模型组相比,H2S干预组大鼠海马组织、肠组织损伤减弱,逃避潜伏期、血浆D-乳酸、肠黏膜细胞凋亡率、肠组织Caspase-3、Bax蛋白、MDA、TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05),穿台次数、血浆H2S水平、小肠绒毛高度、隐窝深度、肠组织Bcl-2蛋白、Nrf2、HO-1、SOD水平升高(P<0.05);Nrf2抑制剂可部分逆转H2S对模型大鼠认知功能、肠道屏障、海马组织的有益作用。结论外源性H_(2)S可明显改善精神分裂症大鼠的认知功能和肠道屏障功能,可能与激活Nrf2/ARE/HO-1通路有关。

α-硫辛酸对帕金森病大鼠脑内黑质多巴胺能神经元保护机制研究

目的探讨α-硫辛酸(LA)对帕金森病(PD)大鼠模型脑内黑质多巴胺能神经元的保护机制。方法60只3月龄雄性Wistar大鼠随机分为对照组、实验组和药物干预组,每组20只。对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油,实验组和药物干预组背部皮下注射鱼藤酮制备PD模型,药物干预组大鼠同时给予LA腹腔注射;采用Western blot检测大鼠中脑多巴胺能神经元中酪氨酸羟化酶(TH)、转录因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)和血红素氧合酶1(HO-1)的表达变化;采用分光光度法检测大鼠脑内纹状体中丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量变化。结果实验组大鼠中脑TH蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05);药物干预组中脑TH蛋白在黑质比鱼藤酮组明显增高(P<0.05),但是较对照组仍有明显减少(P<0.05)。实验组大鼠Nrf2和HO-1蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05);药物干预组Nrf2和HO-1蛋白表达比实验组明显增高(P<0.05),但是较对照组仍有明显降低(P<0.05)。与对照组相比,实验组大鼠纹状体组织中脂质代谢产物MDA含量明显增加(P<0.01),药物干预后纹状体中MDA含量明显减少(P<0.05),但较对照组仍明显增高(P<0.05)。与对照组相比,实验组大鼠GSH的含量明显减少(P<0.01),药物干预后GSH明显增加(P<0.05),但较对照组仍显著降低(P<0.05)。结论 LA能激活Nrf2-ARE信号通路对PD大鼠模型中脑多巴胺能神经元起到有效的神经保护作用,改善PD样症状。

7-羟乙基白杨素对心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制研究

目的探究7-羟乙基白杨素对心肌细胞缺氧损伤的保护作用及其信号转导机制。方法将心肌细胞株H_(9)C_(2)传代后随机分为正常对照组(常氧条件培养24 h)、模型组(1%O_(2)浓度缺氧培养24 h)、白杨素组(1%O_(2)浓度缺氧培养24 h,1.0×10^(-6)mol·L^(-1)白杨素处理)、7-羟乙基白杨素组(1%O_(2)浓度缺氧培养24 h,1.0×10^(-6)mol·L^(-1)7-羟乙基白杨素处理)。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;用WST-1法测定超氧化物歧化酶(SOD)含量;用钼酸铵法测定过氧化氢酶(CAT)含量;用蛋白质印迹法检测血红素加氧酶1(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)蛋白表达水平。结果正常对照组、模型组、白杨素组和7-羟乙基白杨素组的细胞存活率分别为(100.00±4.48)%、(61.95±2.14)%、(86.01±3.60)%和(93.16±2.91)%;SOD活力分别为111.43±3.06、196.12±12.09、162.48±7.64和141.55±2.82;CAT活力分别为3.40±0.32、9.91±0.39、5.51±0.20和4.41±0.43;HO-1蛋白表达水平分别为0.58±0.01、1.22±0.02、0.68±0.01和0.34±0.01;SOD蛋白表达水平分别为0.38±0.01、1.07±0.01、0.92±0.01和0.49±0.01;CAT蛋白表达水平分别为0.73±0.02、1.10±0.02、0.94±0.02和0.67±0.01。模型组的上述指标与正常对照组比较,7-羟乙基白杨素组、白杨素组上述指标与模型组比较,7-羟乙基白杨素组上述指标与白杨素组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论7-羟乙基白杨素通过延缓核因子-E2相关因子/抗氧化应答元件信号途径的激活而提高了心肌细胞的抗氧化损伤能力。

Keapl／Nrfs—ARE信号通路与砷诱导氧化应激致肿瘤机制关系研究进展

流行病学资料表明，砷是一种明确的人类化学致癌物。长期砷暴露可引起慢性砷中毒，引发多种病症。由于砷与机体作用十分复杂，且没有建立致肿瘤动物研究模型，故到目前为止，砷毒性作用机制仍未明确。近年研究表明，砷毒性作用机制主要涉及氧化应激、表观遗传改变和细胞增殖凋亡异常等方面。在众多的砷毒作用机制假说中，砷诱发氧化应激日益成为研究重点。并被认为与砷致肿瘤密切相关。