骨诱导因子通过NF2/Hippo信号通路抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭

目的探究骨诱导因子(osteoglycin,OGN)在甲状腺乳头状癌(PTC)中的作用和调控机制。方法利用基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库分析甲状腺肿瘤组织和正常组织中OGN表达的差异及患者无病生存期。采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析我院的52例PTC肿瘤组织和相应的癌旁正常组织中OGN表达。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析PTC细胞系(K1,TPC-1,IHH-4,KTC-1和BCPAP)和正常甲状腺细胞系(Nthy-ori3-1)中OGN表达水平。使用对照质粒和pcDNA3.1-OGN质粒分别转染TPC-1和KTC-1细胞,分为:control组、pc-NC组和pc-OGN组;随后,将si-RNA-si-RNA-NF2或si-RNA-LATS1共转染至pcDNA3.1-OGN组TPC-1细胞中,分为:pc-NC组、pc-OGN组、pc-OGN+si-NF2组和pc-OGN+si-LATS1组。采用CCK-8、流式细胞术、Transwell和划痕实验分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移水平;蛋白免疫印迹法检测上皮间充质转化相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及NF2和Hippo信号通路关键蛋白Yes关联蛋白1(YAP1)、哺乳动物STE20样蛋白激酶1(MST1)和大肿瘤抑制因子1(LATS1)的蛋白表达。结果GEPIA数据库分析结果显示,与正常组织相比,肿瘤组织中OGN表达水平减少(P<0.01),低水平的OGN表达与较短的无病生存期显著正相关。同时,临床患者样本中肿瘤组织OGN表达水平也较正常组织有明显减少(P<0.01)。与Nthy-ori3-1细胞比较,5种PTC细胞系中OGN mRNA和蛋白表达均有不同程度的减少(P<0.01)。与pc-NC组比较,pc-OGN组TPC-1和KTC-1细胞活力、侵袭和迁移能力减弱(P<0.01),上皮间充质转化相关蛋白N-cadherin和Vimentin表达减少(P<0.01),而细胞凋亡率增加(P<0.01),E-cadherin蛋白表达增加(P<0.01)。与pc-NC组比较,pc-OGN组细胞中NF2表达水平升高(P<0.01),Hippo通路YAP1磷酸化水平减少,MST1和LAST1磷酸化水平增加(P<0.01)。与pc-OGN组细胞相比,pc-OGN+si-NF2组和pc-OGN+si-LATS1组细胞凋亡率显著抑制(P<0.01),细胞侵袭和迁移水平显著增加(P<0.01)。结论OGN通过NF2/Hippo通路抑制细胞增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡,OGN有望成为PTC的治疗靶点。

宫颈癌组织中NHERF1、NF2蛋白表达水平及临床预后意义

目的:分析宫颈癌组织中钠氢交换子调节因子1(NHERF1)、NF2蛋白表达水平及临床预后意义。方法:选取2015年1月—2017年7月我院病理检查确诊的80例宫颈癌癌组织标本及相应的癌旁组织(距肿瘤边缘2cm处)标本。采用免疫组织化学染色法检测所有标本组织中NHERF1、NF2表达水平,并分析NHERF1、NF2表达与宫颈癌患者临床病理特征及预后的关系。结果:宫颈癌组织中NHERF1、NF2阳性表达率分别低于癌旁组织NHERF1、NF2阳性表达率(P<0.05)。NHERF1、NF2表达水平与宫颈癌患者临床分期、分化程度、淋巴结转移存在显著关系(P<0.05)。NHERF1阳性、阴性宫颈癌患者5年生存率分别为66.67%、32.08%,二者差异有统计学意义(P<0.05);NF2阳性、阴性患者5年生存率分别为68.97%、29.41%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。单因素分析得出:不同临床分期、分化程度、淋巴转移、NHERF1及NF2表达宫颈癌患者5年生存率比较差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归模型分析得出:临床Ⅲ/Ⅳ期(OR=2.28)、低分化(OR=3.38)、淋巴转移(OR=4.73)、NHERF1阴性(OR=3.35)、NF2阴性(OR=2.49)均为宫颈癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:宫颈癌组织中NHERF1、NF2蛋白均呈低表达水平,且表达水平与临床病理特征及预后有关,有望作为临床评估宫颈癌预后的有效标志物。

NF2基因及其蛋白merlin的生物学研究进展

NF2基因是一种瘤抑制基因,其失活可导致蛋白质的变性并可诱导肿瘤的发生。其编码的merlin蛋白与细胞的运动和增殖有着较密切的关系,磷酸化使merlin蛋白丧失了抑制肿瘤生长的能力。通过对NF2及merlin蛋白的研究,为研制抗肿瘤药物或干预的靶点提供其理论基础。

NF2基因多态性与脑膜瘤预后的相关性

目的探讨神经纤维瘤病Ⅱ型(NF2)基因多态性与中国人群脑膜瘤易感性及脑膜瘤患者预后的相关性。方法选取2010年5月-2011年1月在首都医科大学附属北京天坛医院神经外科中心接受手术治疗且经病理学检查确诊为脑膜瘤的215例患者为研究对象,应用SNaPshot基因分型技术对NF2基因多态位点rs2530673和rs2530662进行基因分型,分析NF2基因多态性与脑膜瘤预后的相关性。结果NF2基因rs2530673和rs2530662多态性与脑膜瘤易感性相关不显著(P>0.05)。按照WHOⅠ级病理亚型分层,在显性遗传模型下,携带NF2基因rs2530673位点CC基因型的人群发生过渡型脑膜瘤的风险降低(OR=0.506,95%CI 0.266~0.962,P=0.036);NF2基因rs2530673和rs2530662位点多态性与脑膜瘤术后复发相关不显著(P>0.05)。按肿瘤部位分层,在非颅底脑膜瘤组中,NF2基因rs2530673位点多态性与脑膜瘤术后复发相关(P<0.05),携带rs2530673位点CC基因型的脑膜瘤患者术后无进展生存时间缩短,复发风险增高(P<0.05)。多因素分析结果显示,NF2基因多态位点不是脑膜瘤预后的影响因素(P>0.05)。结论NF2基因rs2530673中C等位基因可能是过渡型脑膜瘤发病的保护性因素。NF2基因rs2530673和rs2530662多态性可能与脑膜瘤不相关;但在非颅底脑膜瘤中,NF2基因rs2530673位点多态性可能与肿瘤术后复发相关,且rs2530673位点CC基因型携带者术后复发风险增高。

听神经瘤中NF2基因突变分析

目的明确中国人群听神经瘤中NF2基因突变和大片段缺失比例及其意义。方法收集2007年1月至2010年12月期间84例散发型听神经瘤标本组织,采用标准测序检测患者肿瘤组织和外周血中NF2基因突变,并对其中30例综合采用多重连接依赖探针扩增技术(multiple ligation-dependant probe amplification,MLPA)检测NF2基因大片段缺失。结果标准测序检测听神经瘤组织NF2基因突变率为39.3%,外周血中突变率为零;移码、剪切位点、无义、错义突变比例分别为48.5%、21.2%、24.2%和6.1%,突变分布于第1-15外显子,第8外显子为突变高发外显子(15.2%)。氨基端、链接区、α-螺旋结构区、羧基端突变分别占总突变率的63.6%、6.1%、21.2%和6.1%。MLPA检测发现NF2基因大片段缺失达73.3%,以氨基端为主(56.7%)。标准测序法结合MLPA法测得NF2基因大片段和突变率累计达80.0%。结论散发型听神经瘤中NF2基因突变和大片段缺失率高,且均为体细胞突变。采用标准测序和MLPA结合技术,有助于提高NF2基因突变检出率和精确性。

三重态势能面上H＋NF2反应的理论研究

用量子化学从头计算法对Ｈ＋ＮＦ２体系的三重态势能面进行了研究，采用ＭＰ２（ＦＵＬＬ）／６－３１Ｇ（ｄ）方法计算了反应物、产物、过渡态的构型参数和振动频率，然后用Ｇａｕｓｓｉａｎ－２理论计算了各物种的精确能量。用Ｇ２理论计算得到０Ｋ下反应的势垒高度为８６．４ｋＪ／ｍｏｌ，反应热为－２８１．３ｋＪ／ｍｏｌ。反应热结果与实验值非常一致；热动力学计算的结果排除了Ｈ＋ＮＦ２反应在三重态势能面直接产生ＮＦ（Ｘ）的可能。

MTHFR、MS基因多态及NF2基因甲基化与乳腺癌发病关系的研究

目的：本研究探讨MTHFR、MS基因多态性与抑癌基因NF2甲基化及乳腺癌发病的关系。方法：选取原发性乳腺癌患者47例,健康人52例及乳腺良性病变患者15例,采用RT-PCR、DNA甲基化特异性PCR（methylation-sPecific PCR,MSP）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测NF2的基因表达、甲基化水平及MTHFR、MS基因多态性。结果：NF2基因的表达量在乳腺癌组织（0.16±0.11）及癌旁组织（0.27±0.14）明显低于乳腺良性病变组织（0.64±0.17,P〈0.05）。NF2基因甲基化发生率在乳腺癌组织和癌旁组织中分别为57.4%（27/47）和23.4%（11/47）,两组差异有统计学意义（P〈0.05）。MTHFR677等位基因T型较C等位基因T型在病例组和对照组分布有显著差异（P〈0.05）。携带MTHFR677TT基因型与携带MTHFRCC基因型比较,前者使乳腺癌患病风险增加5.44倍（95%CI,1.91~15.48）。MS2756等位基因G型较等位基因A型在病例组和对照组分布有显著差异（P〈0.05）。携带MS 2756AG基因型与携带MS 2756AA基因型比较,前者使乳腺癌患病风险增加2.73倍（95%CI,1.42~5.24）。MTHFR677多态性与NF2基因甲基化有相关性（χ2=7.29,P〈0.05）。MS2756多态性与NF2基因甲基化无显著关联。结论：NF2甲基化与乳腺癌发生密切相关,MTHFR677、MS2756多态性可以增加乳腺癌的患病风险,MTHFR677多态性可能通过影响部分肿瘤相关基因发生甲基化而调控其表达。

两个Ⅱ型神经纤维瘤病家系的临床表现及其与NF2基因突变的关系

目的报告两个Ⅱ型神经纤维瘤病家系的NF2基因突变,并探讨基因型与表型的关系。方法提取两个家系中的先证者或先证者之子及其家族成员与100名无血缘关系的健康对照者的血液DNA,对先证者的NF2基因的15个外显子(从外显子1到15)及邻近的内含子序列进行聚合酶链反应(PCR),使用直接测序的方法对PCR产物进行检测;对家系1的家族成员内含子2剪接供体处进行PCR及测序;对家系2的家族成员内含子7剪接受体处进行PCR及测序;对100名无血缘关系的健康对照者的内含子2剪接供体和内含子7剪接受体处进行PCR及测序。结果家系1中先证者及其余患者中均存在内含子2剪接供体位点g>t的突变。家系2中患者存在内含子7剪接受体位点a>g的突变。家系中未患病者及对照者中无此突变,并排除了2个位点基因多变性的可能性。结论家系1和2中存在的剪接位点突变,导致了mRNA的剪接异常,影响了Merlin蛋白的生物学功能,使其失去对正常神经细胞生长的调控,进而导致了神经纤维瘤病的发生。

原发性肝癌中NF2基因突变的筛选与分析

目的探讨NF2基因突变与原发性肝癌发生的相关性。方法收集原发性肝癌组织标本144份,其中肝细胞癌106份,肝内胆管细胞癌38份。采用高分辨率单链构象多态性分析结合直接测序的方法筛选肿瘤组织中NF2基因的突变,并与临床参数进行相关性分析。结果 144例原发性肝癌中,共有6例(4.2%)发生了NF2基因突变,其中2例(1.9%)为肝细胞癌、4例(10.5%)为肝内胆管细胞癌。结论 NF2基因突变可能与原发性肝癌,尤其是肝内胆管细胞癌的发生相关。

NF2型神经纤维瘤病的CT诊断

目的分析NF2型神经纤维瘤病的CT表现,提高NF2型神经纤维瘤病诊断水平。方法通过对近年来在我院诊治的经临床证实的3例NF2型神经纤维瘤病的颅脑CT分析,并复习文献资料,阐述其CT影像特征及相关的临床表现。结果3例均有家族史,1例伴NF1型改变,3例NF2型神经纤维瘤病的颅脑CT表现均为双侧听神经瘤伴内听道扩大,肿瘤压迫周围组织器官。结论双侧听神经瘤是典型的NF2型神经纤维瘤病的CT特征,结合家族史可确诊本病。

抑癌基因NF2突变子真核表达载体的构建与表达

目的:分别构建抑癌基因NF2的42位和47位点突变的2种真核表达载体。并在大鼠神经鞘瘤细胞RT4-D6P2T中诱导表达。方法:用定点突变法分别将pcDNA3.1-NF2第42位赖氨酸(Lys)突变为脯氨酸(Pro).第47位苯丙氨酸(Phe)突变为亮氨酸(Leu)构建2种NF2突变子(pcDNA3.1-NF2^(ΔLyn42Pro)和pcDNA3.1-NF2^(ΔPhe47Leu),将3种NF2质粒用脂质体法分别转染RT4细胞.RT—PCR和Western印迹法分析NF2基因及蛋白表达,MTT法检测转染后RT4细胞的增殖情况。结果:测序证实定点突变成功。构建的重组真核表达载体pcDNA3.1-NF2^(ΔLys42Pro)和pcDNA3.1-NF2^(ΔPhe47Leu)均能表达相应的蛋白和mRNA.这2种NF2突变体对RT4细胞抑制率明显低于野生型NF2组。差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了2种能够在RT4中表达的单个点突变的NF2基因真核表达载体。

联合应用PCR-SSCP和PCR产物测序检测神经鞘瘤患者NF2基因Exon7突变及其意义

目的 研究散发神经鞘瘤患者中Ⅱ型多发神经纤维瘤病基因（neurofibromatosis2,NF2）外显子7（Exon7）的突变及意义.方法 采用聚合酶链反应单链构象多态性技术和DNA测序技术检测25例神经鞘瘤中NF2基因Exon7突变.结果 25例神经鞘瘤患者中共发现3例NF2基因Exon7突变,均发生于脊神经鞘瘤,其中剪切受体位点突变1例、移码突变2例.结论 NF2基因Exon7突变可能是脊神经鞘瘤发生的关键因素.

神经鞘瘤中NF2基因外显子2突变及意义

目的 :研究神经鞘瘤中 型多发神经纤维瘤病基因 (NF2 )外显子 2的突变及其意义。方法 :用 PCR- SS-CP、 DNA测序检测 36例神经鞘瘤 (听神经瘤 16例 ,其它 2 0例 )中 NF2基因外显子 2的突变。结果 :我们共发现 4例突变 ,均为听神经瘤 ,其中移码突变 2例、反义突变 2例。结论 :NF2基因外显子 2的突变可能是听神经瘤发生中的关键因素。

NF2、EZR和p53基因甲基化与青海汉族、撒拉族、回族胃癌易感关系

目的 探讨NF2、EZR和p53基因甲基化与青海汉族、撒拉族、回族胃癌易感关系。方法 采用亚硫酸氢盐亚克隆测序法检测青海地区汉族、撒拉族、回族胃癌组织(各30例)、正常胃组织(各20例)中NF2、EZR、p53基因的甲基化程度。结果 NF2、EZR和p53基因在青海汉族、撒拉族、回族胃癌组织中的甲基化程度均高于其正常胃组织(P<0.05),NF2、EZR和p53基因甲基化程度在三个民族胃癌中无差异性。结论 青海地区汉族、撒拉族、回族NF2、EZR和p53基因的甲基化与胃癌易感性有关,但无民族差异性。

NF2/Merlin在原发性肝癌中的表达及临床意义研究

目的研究NF2/Merlin在原发性肝癌中的表达及临床意义。方法免疫组织化学法测定94例肝细胞癌(HCC)和37例肝内胆管细胞癌(ICC)的Merlin表达,并对癌组织中的表达与其临床病理的关系进行分析。结果Merlin蛋白在癌组织中的表达高于癌旁组织。HCC中Merlin蛋白高表达率为20.2%,ICC中Merlin蛋白高表达率为45.9%。在HCC中,Merlin蛋白的表达高低与肿瘤的分期、HBV感染和肿瘤细胞的分化程度均无关,但在ICC中Merlin蛋白的表达高低与肿瘤细胞的分化程度相关。结论 NF2基因的表达可能与原发性肝癌的发生相关。

p53和NF2基因甲基化在宫颈癌中研究进展

抑癌基因失活是宫颈癌的研究热点。近年研究显示,抑癌基因甲基化不仅参与宫颈癌的发生、发展,还可影响宫颈癌的治疗。研究抑癌基因甲基化将有助于宫颈癌的诊断及预后评估。本文就抑癌基因p53及NF2在宫颈癌中的甲基化做一综述。

沙库巴曲缬沙坦钠片通过NF2/Mst1信号通路抑制细胞凋亡改善心肌梗死大鼠心肌纤维化

目的观察沙库巴曲缬沙坦钠片(诺欣妥,Lcz696)对异丙肾上腺素(Iso)诱导的心肌梗死大鼠心肌纤维化及对细胞凋亡和神经纤维蛋白(NF)2/哺乳动物不育系20样激酶(Mst)1通路的影响。方法40只SD雄性大鼠随机分成4组:对照组(Control组)、模型组(Iso组)、Lcz696干预组(Iso+Lcz696组)和缬沙坦(Vdt)干预组(Iso+Vdt组)。采用腹腔注射Iso50 mg/(kg·d):2 d的方法建立急性心肌梗死大鼠模型,以心电图及血浆肌钙蛋白水平确定模型构建是否成功。Iso+Lcz696组给予Lcz69660 mg/(kg·d)溶解于蒸馏水后灌胃,Iso+Vdt组给予Vdt 30 mg/(kg·d)溶解于等量的蒸馏水后灌胃,Iso组和Control组则同时给予等量的蒸馏水灌胃。干预4 w后处死大鼠,以Masson染色检测心肌胶原沉积,以Western印迹法检测半胱天冬酶(Caspase)9、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、NF2、Mst1蛋白表达水平。结果与Control组相比,其余3组大鼠心电图Ⅱ导联T波高耸,ST段弓背向上抬高,血浆肌钙蛋白显著升高,提示急性心肌梗死模型构建成功。Masson染色检测显示Iso组心肌胶原沉积显著增加,而Iso+Lcz696组心肌胶原沉积显著减少,而Iso+Lcz696组与Iso+Vdt组相比,心肌胶原沉积亦显著减少。Iso组大鼠心肌Caspase9、NF2、Mst1蛋白表达显著增加而Bcl-2蛋白表达显著减少(均P<0.05);而与Iso组相比,Iso+Lcz696组Caspase9、NF2、Mst1蛋白表达显著降低而Bcl-2表达显著升高(均P<0.05),Iso+Vdt Caspase9、NF2、Mst1蛋白表达显著降低(均P<0.05),而Bcl-2蛋白表达不明显,但与Iso+Vdt组相比,Iso+Lcz696组NF2、Mst1蛋白减少更明显(均P<0.05)。结论与Vdt相比,Lcz696能更有效地通过抑制心肌细胞凋亡改善Iso诱导的心肌梗死大鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制NF2/Mst1通路有关。

NF2蛋白518位丝氨酸磷酸化状态对其分子内相互作用机制的结构生物学及生物化学研究

目的揭示NF2(neurofibromatosis type 2)蛋白518位丝氨酸的磷酸化如何对其结构与功能进行调节。方法解析野生型NF2WT(无模拟磷酸化突变)和突变型NF2S518D(模拟518位丝氨酸被磷酸化的突变体)蛋白的晶体结构,进一步利用体外Pull-down实验及荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)实验检测了NF2的分子内相互作用。结果由于NF2的C-端在结晶过程中降解,未能观察到NF2WT和NF2S518D两种蛋白质构象的差异,结构分析发现NF2的N-端FERM(Four-point one,Ezrin,Radixin,Moesin)结构域与已有结构报道的FERM结构域具有相似的空间构象。体外Pull-down实验证明生化实验结果提示,相对NF2WTC-端蛋白质而言,NF2S518D的C-端蛋白质与NF2的N-端蛋白质结合更强。FRET实验在波长525 nm处,检测到全长NF2S518D比全长NF2WT产生更强的FRET信号。结论野生型NF2WT处于"开放"状态而模拟磷酸化的突变型NF2S518D处于"闭合"状态。

在NF2中Merlin蛋白与Hippo信号通路的相互作用

多发性神经纤维瘤病（neurofibromatosis，NF），根据其临床及遗传学特征分为1型和2型。1930年，Gardner和Frazier证实神经纤维瘤病Ⅱ型（neurofibro—matosis type2，NF2）为常染色体显性遗传性疾病，临床上通常把NF2分为Wishart型和Gardner型2个亚型。