转录因子NFATc在钙神经素介导的脑缺血再灌注损伤中的作用(英文)

目的 研究转录因子NFATc及NF κB在钙神经素介导的脑缺血再灌注损伤中的作用。方法 Westernblotting和EMSA分子生物学技术。结果 与对照组相比较,CsA明显减低I/R组Fas配体和NFATc的蛋白表达;对照组、I/R组和CsA处理组I κB α蛋白表达无显著区别;未观察到对照组、I/R组和CsA处理组有phospho I κB α蛋白表达;与对照组相比较,CsA明显减低I/R组Fas配体启动子远端和Fas配体启动子近端NFAT结合位点的NFAT DNA结合活性(P<0 01)。结论 转录因子NFATc参与钙神经素介导的脑缺血再灌注损伤,促进CD95配体分子的转录表达;NF κB可能未参与钙神经素介导的脑缺血再灌注损伤的作用机制。

活化T细胞核因子在中枢神经系统疾病中的研究进展

活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)最早被认为是活化的T细胞中与白细胞介素(interleukin,IL)2启动子的抗原受体反应元件2结合的诱导核因子。最近的研究表明,NFAT在哺乳动物神经系统发育、突触可塑性以及神经系统疾病中扮演重要角色。因此,了解NFAT的生物学特点,信号调节机制及其在中枢神经系统疾病中的作用,对于理解疾病的病理机制及药物研发具有重要价值。

干预NFATC1表达调控破骨细胞治疗骨质疏松症的研究进展

NFATc1是一种重要的转录因子,对T细胞分化、心脏瓣膜形态发生、淋巴内皮发育、成骨细胞分化和破骨细胞发生中的谱系选择至关重要。NFATc1是RANKL诱导的破骨细胞分化的主调节剂和主执行者,通过上调负责破骨细胞粘附,迁移,酸化,无机和有机骨基质降解的各种基因,在破骨细胞融合和破骨细胞活化中起着关键作用^([1]),因此在治疗骨质疏松的过程中可以通过干预NFATc1形成复杂的协同控制以促进成骨细胞的形成并抑制破骨细胞的分化^([2]),维持骨骼稳态。

微小RNA-155调节钙调磷酸酶和活化T细胞核因子4表达对心肌细胞肥大的影响

目的研究微小(microRNA,miR)-155对心肌细胞肥大的影响及对钙调磷酸酶(CaN-β)和活化T细胞核因子4(NFAT-4)表达的调控作用。方法培养大鼠心肌细胞H9C2(2-1),血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导心肌细胞肥大,脂质体转染法将miR-155模拟物和miR-155抑制物转染入心肌细胞。分为对照组、AngⅡ组、mimics组、inhibitors组、AngⅡ+mimics组和AngⅡ+inhibitors组。实时荧光定量PCR检测心肌细胞miR-155的表达。逆转录PCR法检测心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)和CaN-βmRNA表达水平。Western blot法检测CaN-β和NFAT-4蛋白表达水平。结果与AngⅡ组比较,AngⅡ+mimics组ANP、β-MHC、心肌细胞表面积、CaN-βmRNA和蛋白表达及NFAT-4蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CaN-β可能为miR-155的作用靶点,miR-155可通过负性调控CaN-β和NFAT-4的表达,减少心肌细胞ANP和β-MHC表达,抑制心肌细胞肥大。

钙离子-钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子c1途径和心血管钙化

心血管系统钙化常见于动脉内膜、动脉中层和心脏瓣膜，既往认为是不受调控的被动的退行性变过程，近年证实是可调控的、类似于骨形成的主动过程。钙离子（Ca^2＋）钙调神经磷酸酶（CAN）-活化T细胞核因子（NFAT）c1信号途径在骨组织、心脏瓣膜及血管中具有重要作用，推测Ca^2＋CaN—NFATc1途径很可能参与血管钙化的调节过程。我们将Ca^2＋-CaN-NFATc1途径在骨组织、心脏瓣膜及血管细胞中的作用做一综述，旨在为钙化研究提供一个新方向。

双苯氟嗪抑制FasL分子表达的基因转录机制(英文)

研究双苯氟嗪对Fas配体分子表达抑制的基因转录机制的影响。通过四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型,所有实验动物缺血15 min,再灌注72 h。实验大鼠随机分为4组:假手术组、缺血再灌注组、双苯氟嗪组及环孢素A组。药物干预于再灌注后2 h内给药,每日1次,连续3 d。双苯氟嗪按20 mg·kg-1灌胃给药,环孢素A 10 mg·kg-1腹腔注射。应用蛋白质印迹和电泳迁移率改变分析技术检测海马CAI区Fas配体(FasL)、转录因子NFATc、I-κB-α、phospho-I-κB-α蛋白表达以及测定FasL分子启动子远端及FasL分子启动子近端NFATFasL-DNA结合活性。结果表明,双苯氟嗪明显降低FasL、NFATc的蛋白表达并显著减少FasL分子启动子远端及FasL分子启动子近端NFAT结合位点的NFAT-DNA结合活性。各组之间I-κB-α蛋白表达无显著区别。未观察到各组phospho-I-κB-α蛋白表达。由此可见,双苯氟嗪通过降低转录因子NFATc的FasL分子的基因转录功能,从而抑制FasL分子的基因表达。

紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制研究

目的:探讨紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制。方法:①分析紫菀酮对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)染色,统计各组破骨细胞数;②分析紫菀酮对Raw 264.7细胞活力的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮的完全培养基,分别培养48 h、120 h后测定各组细胞活力;③分析紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后采用鬼笔环肽和4’,6二脒基2苯基吲哚染色,观察各组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成情况。④分析紫菀酮对核因子κB(nuclear factorκB,NFκB)转录活性的影响。将稳定转染pGL4.32[luc2P/NFκBRE/Hygro]载体的RAW 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组及阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基;培养2 h后,阳性对照组及紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入RANKL溶液,使培养基中RANKL的终浓度为25 ng·mL^(-1);继续培养6 h后,检测各组细胞荧光素酶的荧光强度。⑤分析紫菀酮对核因子κB抑制蛋白激酶α亚基(inhibitor of nuclear factor kappaB kinase subunitα,IκBα)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,每组6孔,分别编号1~6。待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基,继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1),在1号孔加入RANKL溶液后30 min、40 min、50 min、55 min,分别在2号、3号、4号、5号孔加入RANKL溶液至RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1)。在1号孔加入RANKL后60 min,收集各孔细胞,采用蛋白印迹法检测IκBα蛋白的表达量。⑥分析紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组。阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮和25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后,收集各组细胞,采用实时定量PCR检测组织蛋白酶K、空泡型ATP酶d2亚基(vacuolar ATPase subsnit D2,VATPase d2)、TRAP的mRNA表达量。⑦分析紫菀酮对活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,每组4孔,分别编号1~4。待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基。继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1),在1号孔加入RANKL溶液后2 d、4 d,分别在2号、3号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1)。在1号孔加入RNAKL后5 d,收集各孔细胞。采用蛋白印迹法检测NFATc1蛋白的表达量。结果:①紫菀酮对RANKL诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析结果。空白对照组之外的5组破骨细胞数比较,差异有统计学意义[(187.667±14.503)个,(180.000±14.422)个,(174.333±11.060)个,(152.667±5.033)个,(130.667±11.015)个,F=11.767,P=0.001]。紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组破骨细胞数均少于阳性对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组(P=0.004,P=0.000;P=0.017,P=0.000;P=0.047,P=0.001);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞数少于紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组(P=0.044)。②紫菀酮对Raw 264.7细胞活力影响的分析结果。紫菀酮干预48 h、120 h时,5组Raw 264.7细胞活力比较,组间差异均无统计学意义(48 h:0.960±0.101,0.938±0.051,0.916±0.072,0.915±0.079,1.009±0.105,F=0.647,P=0.641;120 h:1.347±0.161,1.388±0.047,1.423±0.473,1.398±0.067,1.357±0.034,F=0.400,P=0.805)。③紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成影响的分析结果。与空白对照组比较,阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组均可见破骨细胞和纤维状肌动蛋白环;与阳性对照组比较,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成均受到抑制,且其受到抑制的程度随紫菀酮干预浓度增加而增强。④紫菀酮对破骨细胞NFκB转录活性影响的分析结果。3组荧光素酶相对荧光强度比较,组间差异有统计学意义(0.058±0.003,1.000±0.044,0.753±0.040,F=613.132,P=0.000)。阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组的荧光素酶相对荧光强度高于空白对照组(P=0.000,P=0.000),紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组的荧光素酶荧光强度低于阳性对照组(P=0.000)。⑤紫菀酮对IκBα蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈先下降后上升趋势,但2组的趋势不完全一致(1.000±0.000,0.414±0.171,0.285±0.104,0.132±0.021,0.157±0.038,0.802±0.066,F=49.839,P=0.000;0.980±0.130,0.632±0.102,0.347±0.037,0.302±0.070,0.546±0.142,1.502±0.345,F=21.435,P=0.000);诱导20 min、30 min、60 min,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量高于阳性对照组(t=-4.018,P=0.016;t=-4.586,P=0.010;t=-3.444,P=0.026)。⑥紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录影响的分析结果。3组破骨细胞VATPased2、组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量比较,组间差异均有统计学意义(1.000±0.089,0.879±0.100,0.530±0.054,F=25.553,P=0.001;1.000±0.030,0.725±0.153,0.719±0.111,F=6.293,P=0.034;1.000±0.326,0.834±0.030,0.656±0.327,F=88.003,P=0.000)。紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组破骨细胞组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量均低于阳性对照组(P=0.023,P=0.001);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞VATPased2、TRAP的mRNA表达量均低于紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和阳性对照组(P=0.000,P=0.002;P=0.000,P=0.000);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞组织蛋白酶K的mRNA表达量低于阳性对照组(P=0.021)。⑦紫菀酮对NFATc1蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈上升趋势,但2组的上升趋势不完全一致(1.000±0.000,1.175±0.007,4.700±0.742,19.430±1.763,F=250.352,P=0.000;1.042±0.035,1.334±0.290,3.531±0.583,15.690±0.823,F=525.669,P=0.000);诱导后5 d,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量低于阳性对照组(t=3.329,P=0.029)。结论:紫菀酮能够抑制体外破骨细胞的分化和活性,其作用机制与抑制NFκB和NFATc1信号通路有关。

重度子痫前期胎盘组织核转录因子5和单核细胞趋化蛋白-1的表达与巨噬细胞浸润

目的探讨核转录因子5（nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、CD68标记的巨噬细胞在不同类型的重度子痫前期胎盘组织中的表达及三者之间的相关性。方法收集2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院住院行剖宫产分娩的早发型重度子痫前期31例（早发组）、晚发型重度子痫前期30例（晚发组），以及同期30例正常孕妇（对照组）的胎盘组织。免疫组化法检测胎盘组织中NFAT5、MCP-1的表达及蜕膜组织中CD68标记的巨噬细胞水平；实时荧光定量聚合酶链反应技术检测胎盘组织中MCP-1和NFAT5的mRNA表达情况，并对蜕膜中的巨噬细胞水平与胎盘组织中NFAT5和MCP-1的mRNA表达进行相关性分析。采用单因素方差分析、t检验、χ^2检验、Pearson相关分析进行统计学分析。结果（1）3组胎盘中NFAT5蛋白表达位于胎盘滋养细胞的胞核与胞质中，绒毛血管内皮细胞内有少量的表达；MCP-1蛋白表达于滋养细胞及绒毛血管内皮细胞周围的胞质内。早发组NFAT5蛋白表达阳性率明显高于晚发组[94%（29/31）与70%（21/30），χ^2=5.720，P=0.017]及对照组[53%（16/30），χ^2=12.743，P=0.001]。早发组MCP-1蛋白表达阳性率明显高于晚发组[90%（28/31）与70%（21/30），χ^2=3.985，P=0.046]及对照组[43%（13/30），χ^2=15.276，P=0.001）]。（2）早发组NFAT5 mRNA表达明显高于晚发组（1.07±0.03与0.92±0.02，P=0.001）及对照组（0.90±0.04，P=0.001）。早发组MCP-1 mRNA表达明显高于晚发组（1.08±0.12与1.02±0.08，P=0.001）和对照组（0.99±0.02，P=0.001）。（3）早发组巨噬细胞计数高于晚发组[（26.18±1.17）与（9.78±0.31）个，t=75.358，P〈0.001]，晚发组显著高于对照组[（9.78±0.31）个与（9.47±0.61）个，t=2.481，P〈0.05]。（4）早发组中NFAT5 mRNA的表达与MCP-1 mRNA的表达呈正相关（r=0.554，P=0.001），NFAT5 mRNA的表达与巨噬细胞计数呈正相关（r=0.527，P=0.003）；MCP-1 mRNA的表达与巨噬细胞计数呈正相关（r=0.395，P=0.031）。结论NFAT5和MCP-1在早发型子痫前期的发病过程中可能有一定的作用。

CsA及VIVIT对自发性高血压大鼠T淋巴细胞CaN/NFAT信号通路的影响

目的:研究环孢菌素A(CsA)及钙调神经磷酸酶(CaN)/活化T细胞核因子(NFAT)信号通路抑制剂VIVIT(Valine isoleucine valine isoleucine threonine,整体形式的寡肽缬氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸)对自发性高血压大鼠(SHR)T淋巴细胞CaN/NFAT信号通路的影响。方法:40只12周龄雄性SHR被随机均分SHR组、安慰剂(PLA)组(SHR组基础上加用PLA)、CsA组(SHR组基础上加用CsA)与VIVIT组(SHR组基础上加用VIVIT),另选择10只同龄健康雄性魏-凯氏大鼠(WKY)作为WKY组。比较各组T淋巴细胞钙调磷酸酶催化亚基A基因(protein phosphatase 3 catalytic A,PPP3CA)蛋白及NFAT2蛋白积分光密度量。结果:与WKY组比较,SHR组、PLA组PPP3CA[7461(11054,17140)比14222(8951,12323)比11716(10219,23755)]、NFAT2蛋白积分光密度量[7715(5204,10224)比24759(16722,32796)比18441(13947,22934)]显著升高;与SHR组、PLA组比较,CsA组、VIVIT组PPP3CA[14222(8951,12323),11716(10219,23755)比6255(11683,19635),7474(5949,10066)]、NFAT2蛋白积分光密度量[24759(16722,32796),18441(13947,22934)比9300(5388,13210),10146(5949,10066)]显著降低,P<0.05或<0.01。结论:自发性高血压大鼠T细胞CaN/NFAT信号通路活性显著升高,CsA和VIVIT对自发性高血压大鼠T细胞CaN/NFAT信号通路有显著抑制作用。

AngⅡ上调TRPC6、NFAT2介导2型糖尿病肾病足细胞损伤

目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)、活化T细胞核因子2(NFAT2)参与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的2型糖尿病肾病足细胞损伤的可能机制。方法 制备2型糖尿病大鼠模型,随机分为糖尿病组(DM组,n=11)、缬沙坦组(ARB组,n=11),同时设置正常对照组(NC组,n=10),ARB组给予缬沙坦40mg/(kg·d)灌胃,DM组及NC组给予等量生理盐水灌胃,干预12周后检测各组尿清蛋白排泄率(UAE),光镜、电镜下观察肾脏及足细胞病理改变,Western blot方法测定AngⅡ、NFAT2及TRPC6蛋白的表达水平。结果 DM组UAE显著高于NC组(F=261.834,t=22.80,P<0.01),ARB组UAE水平显著低于DM组(t=13.08,P<0.01)。光镜下可见,DM组较NC组肾小球体积增大、肾基底膜增厚、系膜细胞及系膜基质增生;电镜下可见,DM组足细胞数量减少,足突融合、消失,ARB组上述病变较DM组明显减轻。与NC组相比,DM组AngⅡ、NFAT2、TRPC6蛋白表达水平均显著升高(F=290.888~639.364,t=15.00~29.50,P<0.01),ARB组较DM组明显减低(t=22.81~34.01,P<0.01)。结论 AngⅡ可能通过上调TRPC6、NFAT2介导2型糖尿病足细胞损伤。

人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响

背景:体外小鼠颅盖骨实验已证实了其结核杆菌热休克蛋白10的破骨效应。目的:在诱导破骨细胞分化的体外细胞培养系统中,研究重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞分化的影响及相关机制。方法:选用人巨噬细胞集落刺激因子依赖性附着性血液单个核细胞,实验分为:核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、核因子κB受体活化因子配体组、重组结核杆菌热休克蛋白10组(1 mg/L)、阴性对照组(完全培养基),核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、重组结核杆菌热休克蛋白10组中重组结核杆菌热休克蛋白10质量浓度为1 mg/L,在含有巨噬细胞集落刺激因子的a-MEM培养液重悬单核细胞,各组培养7,14,21 d后,观察所形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色多核细胞的形态、数目、骨吸收面积;各组NFATc1、c-Fos基因及蛋白表达情况。结果与结论:阴性对照组无抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成,其余各组均有抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;重组结核杆菌热休克蛋白10组形成的破骨细胞分化细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组;阴性对照组NFATc1、c-Fos基因表达水平显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组和重组结核杆菌热休克蛋白10组,而重组结核杆菌热休克蛋白10组表达NFATc1、c-Fos蛋白,显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组。提示结核杆菌热休克蛋白10参与破骨细胞分化的形成,可能与诱导相关基因NFATc1、c-Fos表达上调有关。

类风湿关节炎滑膜活化T细胞核转录因子c4表达及其与血管生成的关系

目的探讨活化T细胞核转录因子c4(NFATc4)在类风湿关节炎(RA)滑膜血管生成中的作用。方法采用免疫组化单染及双染检测11例RA滑膜NFATc4、CD31及血管内皮细胞生长因子(VEGF),并与32例非RA滑膜组织(骨关节炎、创伤性关节炎及正常滑膜)对照,以滑膜微血管计数(MVC)及VEGF标志血管生成,并以DAS28-ESR表示RA病情活动度,评估NFATc4的表达并分析其与滑膜血管生成及病情活动度的关系。结果 RA滑膜衬里层及衬里下层均有NFATc4表达,尤其血管内皮细胞呈丰富表达;RA滑膜衬里层NFATc4表达高于正常滑膜衬里层(P<0.05),而与其他两组滑膜衬里层无统计学差异(P>0.05),RA滑膜衬里下层NFATc4的表达高于各组非RA滑膜衬里下层(P<0.05);RA滑膜衬里层、衬里下层NFATc4的表达与衬里下层MVC及VEGF表达呈正相关;RA滑膜血管内皮细胞NFATc4的表达与MVC呈正相关,但与衬里下层VEGF表达无明显相关;RA滑膜NFATc4衬里下层的表达与DAS28-ESR呈正相关。结论 NFATc4在RA滑膜表达上调,不仅与滑膜血管生成呈正相关,还与DAS28-ESR呈正相关,提示其可能参与RA滑膜血管生成过程。

共刺激分子OX40-OX40L相互作用对ApoE-/-小鼠淋巴细胞活化T细胞核因子C1表达的影响

目的 探讨共刺激分子OX40-OX40L相互作用对载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠淋巴细胞中活化T细胞核因子C1（NFATc1）表达的影响.方法 采用未经治疗的ApoE-/-小鼠颈动脉粥样斑块模型,取其脾脏淋巴细胞,以不同浓度刺激型OX40抗体或抑制型OX40L抗体体外特异性刺激或阻断OX40-OX40L相互作用,不同时间点收获细胞,分别应用实时荧光定量PCR和流式细胞技术检测小鼠淋巴细胞NFATc1 mRNA和蛋白表达.结果 （1）抗OX40抗体特异性刺激OX40-OX40L轴后,小鼠淋巴细胞NFATc1 mRNA及蛋白表达明显上调,anti-OX40浓度为20 μg/ml时刺激作用最强,刺激时间24 h最佳（P〈0.01）.（2）抗OX40L抗体特异性阻断OX40-OX40L轴能明显抑制NFATc1 mRNA及蛋白表达,anti-OX40L为20 μg/ml时抑制作用最强,抑制时间24 h最佳（P〈0.001）.结论 OX40-OX40L相互作用能调控ApoE-/-小鼠淋巴细胞NFATc1的表达.

活化T细胞核因子c1在慢性肾衰竭大鼠血管钙化中的作用

目的探讨活化T细胞核因子c1（NFATc1）在慢性肾衰竭大鼠血管钙化中的作用。方法将19只雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组6只（甲基纤维素灌胃）、慢性肾衰竭组6只（5/6肾切除＋甲基纤维素灌胃）、慢性肾衰竭血管钙化组7只（5/6肾切除＋甲基纤维素灌胃＋骨化三醇灌胃）。采用von Kossa染色方法和邻甲酚酞络合酮比色法测定检测大鼠主动脉钙化情况；免疫组织化学方法检测大鼠主动脉NFATc1蛋白表达情况。体外原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs），用β-甘油磷酸（β-GP）诱导钙化。将细胞随机分为3组：正常对照组、钙化组（10 mmol/L β-GP）和环孢素A（CsA）干预组[高磷培养基基础上添加CsA（调整浓度为1 μg/ml）]。采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况；酶联免疫吸附法检测细胞碱性磷酸酶（ALP）活性；RT-PCR和Western印迹法检测NFATc1、Runt相关转录因子2（Runx2）的表达。结果体内实验结果显示，与假手术组和慢性肾衰竭组相比，慢性肾衰竭血管钙化组的大鼠主动脉NFATc1免疫组化评分较高（7.20±0.46比1.52±0.77、2.04±1.31，均P〈0.05）。体外实验结果显示，高磷环境成功诱导了VSMCs钙化发生；RT-PCR和Western印迹结果显示钙化组VSMCs的NFATc1和Runx2表达高于正常对照组（均P〈0.05）；CsA干预后VSMCs钙盐沉积减少[（60.86±7.95）比（107.20±11.07） mg/g，P〈0.05]，Runx2表达（mRNA和蛋白水平）及ALP活性亦降低[（48.63±3.02）比（98.75±3.46） U/g，P〈0.05]。结论NFATc1在慢性肾衰竭大鼠血管钙化发生中可能起促进作用，其作用机制可能与促进VSMCs成骨样表型转化有关。

CD137分子通过微小RNA-145a-5p调控载脂蛋白E-/-小鼠活化T细胞核因子c1表达

目的 探讨CD137分子信号通路是否通过微小RNA-145a-5p （miR-145a-5p）调控活化T细胞核因子c1（NFATc1）表达.方法 选取18只载脂蛋白（Apo）E-/-小鼠,8周龄,颈动脉硅胶圈植入建立模型后,根据随机区组法分为对照组、CD137刺激组和CD137抑制组,每组6只;采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测小鼠颈动脉斑块以及平滑肌细胞中miR-145a-5p含量;免疫荧光检测斑块中NFATc1分布,qRT-PCR、Western blot方法检测小鼠体内、外NFATc1表达.用脂质体转染miR-145a-5p的拟似物和抑制物进入血管平滑肌细胞（VSMC）;通过分子克隆技术构建NFATc1真核表达载体p3xFLAG-NFATc1、p3xFLAG-NFATc 1-3＇ UTR.构建双荧光素酶报告载体psicheck2-NFATc1,并通过同源重组法构建psicheck2-NFATc1的突变载体psicheck2-NFATc1-Mut转染细胞后分为正常组和突变组.结果 CD137刺激组ApoE-/-小鼠斑块及VSMC中miR-145a-5p水平明显低于对照组（分别为0.21 ±0.06比1.00±0.00,P＜0.05;0.22±0.07比0.50±0.12,P＜0.05）,斑块内NFATc1表达高于对照组（P ＜0.05）;CD137抑制组ApoE-/-小鼠斑块及VSMC中miR-145a-5p水平低于CD137刺激组（分别为0.74±0.17比0.21 ±0.06,P＜0.05;0.78 ±0.12比0.22 ±0.07,P＜0.05）,而斑块内NFATc1表达高于CD137刺激组（P＜0.05）.miR-145a-5p的拟似物处理组中NFATc1表达低于对照组,而抑制物处理组中NFATc1表达高于对照组（P＜0.05）;p3xFLAG-NFATc1-3＆#39; UTR过表达组中外源性NFATc1表达低于对照组（P＜0.05）;双荧光素酶实验中,正常组中拟似物处理组荧光水平明显低于对照组（0.56±0.08比1.00 ±0.00,P＜0.05）,突变组中荧光水平与对照组比较差异无统计学意义.结论 CD137分子能够通过miR-145a-5p调控NFATc1的表达.

他克莫司通过下调NFATc2抑制大鼠球囊损伤后颈总动脉内膜增生

目的观察他克莫司对大鼠球囊损伤后血管壁内膜增生的干预作用并探讨其机制。方法将27只健康雄性SD大鼠随机分成假手术组、球囊损伤模型组及他克莫司组(n=9),除假手术组外,其余大鼠建立颈总动脉球囊损伤模型。他克莫司组大鼠灌胃给予他克莫司(1 mg·kg^(-1)),假手术组和球囊损伤模型组大鼠灌胃给予相同体积的双蒸水,每日1次,连续给药14 d。最后一次给药后24 h,取损伤侧血管行HE染色,计算管腔面积、血管内膜面积(NIA)及内膜面积/中膜面积(NIA/MA);real-time PCR法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)^(-1)βm RNA表达,免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、活化T细胞核因子(NFAT)c2蛋白在血管壁中的表达。结果与假手术组相比,球囊损伤模型组管腔面积明显减小,NIA、NIA/MA增加,TNF-α和IL^(-1)βm RNA表达增高,PCNA、NFATc2蛋白表达增高(P<0.01)。与球囊损伤模型组相比,他克莫司组管腔面积增加,NIA增厚程度减轻,NIA/MA减小,TNF-α和IL^(-1)βm RNA的表达降低,PCNA、NFATc2蛋白的表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论他克莫司可明显抑制血管内膜过度增生,其机制可能与其下调血管壁NFATc2蛋白和TNF-α、IL^(-1)βm RNA表达有关。

活化T细胞核因子与肿瘤的研究进展

活化T细胞核因子(NFAT)是一组在哺乳动物组织细胞中广泛表达的转录因子,具有多向调节功能,在细胞分化、生长过程中起重要作用。近年来,越来越多的研究发现NFAT与多种信号转导通路存在相互作用,在肿瘤的形成、生长、恶性转化、血管生成、侵袭浸润和肿瘤转移等方面发挥着重要的功能,与肿瘤的发生和浸润转移有着十分密切的关系。NFAT分子目前已成为肿瘤研究中的热点,并有可能成为新的肿瘤治疗靶点。本文主要对NFAT分子在肿瘤发生、发展过程中的作用作一综述。

缬沙坦对高糖诱导肾小球足细胞活化T细胞核因子2活化及细胞凋亡的影响

目的探讨缬沙坦对高糖诱导肾小球足细胞活化T细胞核因子2(NFAT2)活化及细胞凋亡的影响。方法将分化成熟的足细胞分组给予不同糖浓度、不同干预时间、NFAT2抑制剂11R-VIVIT、NFAT2活化剂ionomycin等刺激,采用Western blot检测足细胞胞核中NFAT2的表达水平、流式细胞仪检测足细胞凋亡情况。结果高糖能刺激足细胞NFAT2活化入核,20 mmol.L-1葡萄糖作用2 h时NFAT2活化入核达到高峰;这与Ionomycin作用相似,两者刺激下的NFAT2的表达水平无显著差异(P>0.05)。缬沙坦、11R-VIVIT与高糖共同刺激下,足细胞核中NFAT2的表达水平低于单纯高糖刺激(P<0.01),而缬沙坦和11R-VIVIT作用无显著差异(P>0.05)。20 mmol.L-1葡萄糖作用48 h时,足细胞凋亡率为(21.47±6.24)%,高于5.3 mmol.L-1葡萄糖作用48 h[(12.27±1.31)%,P<0.05]。缬沙坦与高糖共同刺激下,足细胞凋亡率低于单纯高糖刺激(P<0.01),与11R-VIVIT和高糖共同刺激下的凋亡率无显著差异(P>0.05)。结论缬沙坦可能通过抑制高糖诱导的足细胞NFAT2的过度活化,从而降低高糖诱导的细胞凋亡。

CDl37信号通过核因子KB影响小鼠主动脉平滑肌细胞活化T细胞核因子cl表达

目的探讨CDl37信号是否通过核因子-KB（NF—KB）调控小鼠血管平滑肌细胞（VSMC）活化T细胞核因子cl（mclear factor of activated T cells cl，NFATcl）表达。方法采用组织块贴壁法对正常C57BL／6J小鼠的VSMC进行原代培养。以每孔2×105^个VSMC接种于6孔板中培养，待其贴壁后，饥饿24h，用含10％FBS＋肿瘤坏死因子（TNF-a，终浓度10ng／m1）的DMEM培养基分别培养细胞0、4、8、12．24、36、48h后，收获细胞用于CDl37mRNA和蛋白的检测，选取CDl37表达最多的时间点进行下一步实验。细胞实验分为3组，即对照组[含10％FBS、TNF-α（终浓度10ng／m1）、DMEM培养基共同干预]、刺激组[对照组干预基础上加CDl37mAb激动剂（终浓度10μg/m1）]和抑制组[对照组干预基础上加PDTC（终浓度30μmol／L），然后加CDl37mAb激动剂（终浓度10μ/m1）]。加入不同干预因素后继续培养，分别于90rain时收集核内外磷酸化（P）-NF—KBp65、核因子KB抑制蛋白（IKB-α），24h收集细胞总RNA和NFATcl蛋白备检。逆转录定量聚合酶链反应检测CDl37和NFATclmRNA表达水平。流式细胞术检测CDl37膜蛋白表达水平。蛋白印迹法检测IKB—α、NF．KBp65、p-NF—KBp65和NFATcl蛋白表达水平。结果（1）TNF-α诱导VSMC表达CDl37的结果：TNF．d刺激VSMC4、8、12、24、36、48h后，细胞CDl37mRNA表达均上调。RT—PCR结果示，以24h组CDl37mRNA升高最为显著，以未刺激（即0h）组的细胞为对照进行比较，差异有统计学意义（40．00±2．83比1，P〈0．05）。流式细胞术检测亦显示24h组CDl37膜蛋白升高最为显著。（2）各组VSMC中p-NF-KBp65蛋白表达水平的检测结果：刺激组VSMC胞浆中P-NF—KBp65蛋白表达水平高于对照组（8．34±0．28比1，P〈0．05），而IkB一仅蛋白表达水平低于对照组（1比2．70±0．28，P〈0．05）。抑制组VSMC胞浆中p-NF—KBp65蛋白表达水平低于刺激组（1．15±0．14比8．34±0．28。P〈0．05），而IkB．“蛋白表达水平则高于刺激组（1．78±0．74比1，P〈0．05）。刺激组VMSC细胞核内p-NF-KBp65蛋白表达水平高于对照组（2．64±0．42比1，P〈0．05），而抑制组表达水平则低于刺激组（2．09±0．12比2．64±0．42，P〈0，05）。（3）各组VSMC中NFATclmRNA和蛋白表达水平的检测结果：干预24h后，刺激组VSMC中NFATclmRNA表达水平高于对照组（2．07±0．09比1，P〈0．05），NFATcl蛋白表达水平亦高于对照组（1．75±0．07比1，P〈0．05）。而抑制组VSMC中NFATclmRNA表达水平低于刺激组（1．15±0．07比2．07±0．09，P〈0．05），蛋白表达水平亦低于刺激组（0．90±0．11比1．75±0．07，P〈0．05）。结论CD137信号通过NF-KBp65影响小鼠VSMC中NFATcl的表达。

CD137-CD137L信号通路通过活化T细胞核因子c1促进小鼠动脉粥样硬化斑块内血管新生

目的探讨CD137-CD137L信号通路是否通过活化T细胞核因子c1（NFATc1）促进动脉粥样硬化斑块内血管新生。方法将载脂蛋白E基因敲除小鼠分为3组，即对照组、CD137刺激组和CD137抑制组，每组均为5只小鼠，采用免疫组织化学法检测小鼠主动脉斑块内的CD31含量。将小鼠内皮细胞（bend．3）分为4组，即空白对照组、IgG同型对照组、CD137刺激组和CD137抑制组，采用Western blot检测内皮细胞的NFATcl总蛋白和核蛋白水平。采用流式细胞术检测内皮细胞膜表面的CD137蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测内皮细胞裂解液中的CD137蛋白水平。采用Transwell迁移实验检测内皮细胞的迁移能力。将内皮细胞分为5组，即对照组、CD137刺激组、沉默NFATc1细胞株＋CD137刺激组、CD137抑制组和过表达NFATc1细胞株＋CD137抑制组，检测各组内皮细胞的管腔形成能力。结果（1）CD137刺激组的斑块内CD31表达水平高于对照组（1191±187比115±30，P〈0．05）；CD137抑制组的斑块内CD31表达水平（450±92）低于CD137刺激组（P〈0．05）。（2）CD137刺激组内皮细胞内的NFATc1总蛋白（2．18±0．30比1．00±0．00，P〈0．05）和核蛋白（3．07±0．03比1．00±0．00，P〈0．05）水平均高于IgG同型对照组；CD137抑制组内皮细胞内的NFATc1总蛋白（0．84±0．09）和核蛋白（0．82±0．04）水平均低于CD137刺激组（P均〈0．05）。（3）流式细胞术显示，肿瘤坏死因子．d刺激后内皮细胞的CD137荧光强度高于正常内皮细胞（5163±329比1660±162，P〈0．05）。（4）ELISA显示，肿瘤坏死因子-α刺激后内皮细胞裂解液中的CD137蛋白水平高于正常内皮细胞[（573．4±23．7）pg／mg比（69．5±16．7）pg／mg，P〈0．05]。（5）CD137刺激组的内皮细胞迁移数量多于IgG同型对照组（1．19±0．13比1．00±0．00，P〈0．05）；CD137抑制组的内皮细胞迁移数量（0．82±0．06）少于CD137刺激组（P〈0．05）。（6）内皮细胞管腔形成实验显示，CD137刺激组的内皮细胞小管长度[（5．76±0．18）mm比（4．21±0．11）mm，P〈0．05]大于对照组，分支数量[（29．38±1．28）个比（21．13±0．96）个，P〈0．05]多于对照组；沉默NFATc1细胞株＋CD137刺激组的内皮细胞小管长度[（1．90±0．11）mm]小于CD137刺激组，分支数量[（8．91±0．72）个]少于CD137刺激组（P均〈0．05）；CD137抑制组的内皮细胞小管长度[（1．28±0．34）mm]小于CD137刺激组，分支数量[（5．07±0．35）个]少于CD137刺激组（P均〈0．05）；过表达NFATc1细胞株＋CD137抑制组的内皮细胞小管长度[（4．82±0．09）mm]大于CD137抑制组，分支数量[（24．44±1．05）个]多于CD137抑制组（P均〈0．05）。结论CD137-CD137L信号通路可能通过NFATc1促进小鼠动脉粥样硬化斑块内的血管新生。