NFATc1在骨质疏松症中的研究进展

骨重塑过程不平衡是骨质疏松症发生的重要机制之一,其主要是由于破骨细胞对骨的重吸收超过了成骨细胞介导的骨形成。NFATc1被证实参与了调控骨吸收过程。笔者综述了NFATc1在破骨细胞中调控的信号通路与分子机制,拟为骨质疏松症提供新的治疗思路和潜在的治疗靶点。并得出以下结论:①当骨吸收过程中破骨细胞的介入程度超过成骨细胞的介入程度时,从而导致骨重塑过程失去平衡,而骨质疏松症则将持续发展;②NFATc1在破骨细胞吸收过程中的关键转录调控是通过RANKL-RANK、NF-κB、MAPK和Ca^(2+)信号通路,调控破骨细胞在骨代谢过程中的生成和分化,从而介导破骨细胞过度生成引起的骨形成和骨吸收之间的失衡;③目前抗骨质疏松药物策略并未对该疾病产生非常显著的影响;④关于生物材料靶向NFATc1的研究还处于起步阶段,仍需深入探索。

骨疏康干预破骨细胞:激活核因子E2相关因子2调控c-Fos/NFATc1通路

背景:已有研究表明,骨疏康通过调节核苷酸、氨基酸代谢和免疫机制影响骨骼代谢,目前骨疏康治疗骨质疏松症的机制研究主要聚焦于调控成骨细胞,对破骨细胞的关注较少。目的:以RAW 264.7细胞为实验对象,从破骨细胞角度探讨骨疏康治疗骨质疏松症的机制。方法:取8周龄雌性SD大鼠24只,采用随机数字表法分为4组(n=6),3个实验组分别灌胃给予1,2,4 g/kg的骨疏康药液(2次/d),对照组灌胃给予等量蒸馏水(2次/d),连续灌胃7 d后抽取大鼠主动脉血,离心收集血清,同组血清合并,获得低、中、高浓度的骨疏康含药血清及正常血清,进行后续实验。①将RAW 264.7细胞分6组培养:对照组加入正常血清,低、中、高浓度组分别加入低、中、高浓度的骨疏康含药血清,Nrf2抑制剂组加入核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)抑制剂ML385,Nrf2激活剂组加入Nrf2激活剂t-BHQ,采用CCK8法检测细胞相对活性。②将第3代RAW 264.7细胞分5组培养:空白对照组加入正常血清,破骨组加入核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL),低、中、高浓度组在加入RANKL的基础上分别加入低、中、高浓度的骨疏康含药血清,培养5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸染色。③将RAW 264.7细胞分5组培养:空白对照组加入正常血清,破骨组加入正常血清与RANKL,高浓度+破骨组加入RANKL+高浓度骨疏康含药血清,破骨+Nrf2激动剂组加入RANKL+t-BHQ,高浓度+破骨+Nrf2抑制剂组加入RANKL+高浓度骨疏康含药血清+ML385,培养5 d后进行Western Blot与活性氧含量检测。结果与结论:①CCK8检测结果显示,骨疏康含药血清及Nrf2抑制剂、激动剂对RAW 264.7细胞活力无明显影响;②抗酒石酸酸性磷酸染色结果显示,骨疏康含药血清呈浓度依赖性抑制破骨细胞的分化;③Western Blot与活性氧含量检测结果显示,与空白对照组比较,破骨组Nrf2蛋白表达降低(P<0.05),c-Fos、NFATc1蛋白表达与活性氧含量升高(P<0.05);与破骨组比较,高浓度+破骨组、破骨+Nrf2激动剂组、高浓度+破骨+Nrf2抑制剂组Nrf2蛋白表达升高、活性氧含量降低(P<0.05),高浓度+破骨组、破骨+Nrf2激动剂组c-Fos、NFATc1蛋白表达降低(P<0.05);与高浓度+破骨组比较,高浓度+破骨+Nrf2抑制剂组Nrf2蛋白表达降低(P<0.05),活性氧含量升高(P<0.05);④结果表明,骨疏康通过激活Nrf2减少活性氧生成,进而抑制下游c-Fos/NFATc1通路表达和破骨细胞分化。

干涉NFATc1表达影响细胞周期运转抑制结肠癌细胞增殖的机制

目的根据活化T-细胞核因子1(NFATc1)在结肠癌中的表达及预后情况,利用shRNA转染细胞干涉NFATc1表达,检测NFATc1对结肠癌细胞增殖各表型的影响,并初步分析可能的机制。方法利用TCGA数据库分析NFATc1高表达对结肠癌预后的影响,取临床结肠癌患者术后样本进行免疫组化染色,比较NFATc1在结肠癌组织和癌旁组织中的表达差异。通过将shRNA转染结肠癌细胞干涉NFATc1后,利用CCK-8测定NFATc1干涉后的细胞增殖变化;利用克隆形成实验预测NFATc1干涉后结肠癌细胞成瘤潜力;利用碘化丙锭染色细胞,通过流式细胞仪分析细胞周期分布变化;利用qPCR检测NFATc1对结肠癌细胞周期相关因子转录活性的影响。结果生存曲线显示NFATc1高表达的结肠癌患者预后更差。临床结肠癌组织NFATc1的表达高于癌旁正常组织。干涉NFATc1导致结肠癌细胞的增殖速率明显降低,克隆形成能力显著减弱,细胞周期出现G0/G1期停滞。qPCR结果表明干涉NFATc1后,多个关键的细胞周期抑制因子转录活性明显上升。结论NFATc1通过抑制细胞周期调控因子转录活性促进细胞周期运转,从而促进结肠癌细胞增殖和成瘤能力。

基于Btk-PLCγ2-NFATc1通路分析调控miR-17-5p表达对根尖周炎大鼠骨破坏的修复作用

目的 分析基于布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)-磷脂酰肌醇特异性磷酯酶(PLCγ2)-活化T-细胞核因子(NFATc)1通路调控微小RNA-17-5p(miR-17-5p)表达对根尖周炎大鼠骨破坏的修复作用。方法 将60只大鼠随机分为正常(A)组、模型(B)组、上调(C)组、下调(D)组各15只,除A组外,其余大鼠均建立根尖周炎模型,C组、D组分别转染miR-17-5p模拟物(mimics)、miR-17-5p抑制剂(inhibitor)行上调、下调转染,A组、B组给予等体积生理盐水干预。观察各组病理组织学、miR-17-5p表达量、骨细胞阳性细胞数、炎性浸润指标水平及Btk-PLCγ2-NFATc1通路蛋白表达量。结果 与C组相比,D组miR-17-5p表达量,炎性浸润指标水平,Btk、PLCγ2、NFATc1蛋白表达量显著较低(P<0.05)。与C组相比,D组骨细胞阳性细胞数显著较少(P<0.05)。结论 下调miR-17-5p可能通过下调Btk、PLCγ2、NFATc1蛋白表达量、抑制Btk-PLCγ2-NFATc1通路,减少骨细胞阳性细胞数,对骨破坏起一定的修复作用。

破骨细胞中NFATc1相关调节研究进展

活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1,NFATc1)是一种重要的转录因子。在破骨细胞中,它由上游RANKL信号通路的诱导、Ca^(2+)相关协同刺激信号通路与Ca^(2+)非依赖信号通路的扩增,Lhx2、IRF8、Mafb及Bcl6等细胞因子负反馈诱导,在NFATc1转录过程中的启动、扩增及靶向作用三个阶段通过复杂交互的调节影响其下游各种靶基因及蛋白,最终介导破骨细胞的分化、融合及对无机和有机骨基质的降解作用。宏观上,NFATc1还受到外界机械应力的影响从而在破骨细胞生长过程中发挥作用;并且NFATc1的调节过程受其自身节律的影响。本文就NFATc1的结构、相关调节机制和对破骨细胞的作用研究进展进行综述。

ROC曲线和Logistic回归评估PAF联合NFATc1对冠心病的诊断价值

目的探讨ROC曲线和Logistic回归评估血小板活化因子(PAF)和活化T淋巴细胞核因子c1(NAFTc1)对冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的诊断价值。方法选取2014年1月-2016年1月该院就诊的188例疑似冠心病患者为研究对象,根据冠状动脉造影结果分为对照组和冠心病组,其中对照组56例,冠心病组132例。采用ELISA法检测两组患者血清PAF、NAFTc1浓度,采用Logistic回归方程和ROC曲线判定单项检测和联合检测在冠心病诊断中的价值。结果对照组和冠心病组血清PAF浓度分别为(8.95±5.74)和(18.13±4.72)ng/ml,NAFTc1浓度分别为(22.78±3.15)和(30.58±5.24)pg/ml,两组比较差异有统计学意义(P <0.05)。以PAF、NAFTc1 2个单因素为自变量,进行二项分类Logistic回归分析,得到Logistic回归模型:Logit(P)=-8.463+0.417PAF+0.098NAFTc1,该模型诊断准确率为85.64%。PAF、NAFTc1、Logistic回归模型联合检测的曲线下面积分别为0.806、0.815及0.900,差异有统计学意义(P <0.05),Logistic回归模型联合检测的95%CI(0.838,0.962)。PAF检测阈值为9.75 ng/ml,NAFTc1检测阈值为23.95 pg/ml,Logistic回归模型联合检测敏感性为0.86,特异性为0.71。结论 PAF联合NFATc1检测效果优于单项检测,可用于冠心病筛查,具有较高的诊断价值。

辛伐他汀通过NFATc1通路促进破骨细胞的凋亡

目的探索辛伐他汀(SIM)调节破骨细胞凋亡机制的实验研究。方法细胞分A组(Control组)、B组(sRANKL+M-CSF组)、C组(SIM+sRANKL+M-CSF组)、D组(VIVIT peptide+sRANKL+M-CSF组)、E组(SIM+VIVIT peptide+sRANKL+M-CSF组);WST-1检测不同浓度的辛伐他汀对破骨细胞增殖活性影响;流式细胞仪检测SIM及加入NFATc1通路抑制剂VIVIT peptide后对破骨细胞凋亡的影响;免疫荧光检测NFATc1向细胞核的转位情况;Western blot检测SIM对细胞核内NFATc1磷酸化的影响。结果WST-1显示,与对照组相比,SIM(10^-6mol/L)作用24h、48h明显抑制破骨细胞的增殖活性(P=0.039<0.05,P=0.022<0.05)。与对照组相比,SIM处理后破骨细胞G0/G1期受到抑制(P=0.041<0.05),SIM增加了Sub-G1期的细胞数(P=0.028<0.05)。倒置显微镜显示SIM促进破骨细胞凋亡,凋亡的细胞漂浮于培养基中。细胞核的DAPI染色和流式细胞仪检测结果显示SIM促进破骨细胞凋亡(P=0.002<0.01),VIVIT peptide单独处理组(P=0.015<0.05),或SIM+VIVIT peptide组的细胞凋亡数与SIM组相似(P=0.08>0.05)。免疫荧光显示SIM抑制NFATc1的细胞核内转位,免疫印迹结果显示,SIM抑制NFATc1通路蛋白的磷酸化(P=0.013<0.05)。结论SIM通过NFATc1信号通路促进破骨细胞凋亡。

NFATc1可能通过调节RhoA/ROCK信号通路影响乳腺癌细胞的增殖与凋亡

目的:检测NFATc1在乳腺癌患者癌及癌旁组织的表达,并探讨其表达对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法:收集于我院就诊的39例乳腺癌患者癌及癌旁组织,采用RT-PCR技术、免疫印迹及免疫组化染色技术检测NFATc1在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达状况。利用小干扰RNA(siRNA)构建NFATc1稳定敲除的MCF7及MDA-MB-231细胞系。利用CCK-8试剂盒及克隆形成实验检测NFATc1敲除对乳腺癌细胞增殖的影响,同时利用Ki67染色检测对照组和NFATc1敲除组乳腺癌细胞中Ki67阳性细胞的比例。此外,采用流式细胞学技术检测NFATc1基因敲除对乳腺癌细胞凋亡的影响,最后利用免疫印迹技术分析各组细胞RhoA/ROCK信号通路的表达状况。结果:NFATc1在乳腺癌患者癌组织中的mRNA及蛋白表达显著增高(P<0.05)。流式细胞学结果表明NFATc1 siRNA干预能够显著促进两组乳腺癌细胞系的凋亡(P<0.05)。此外,Ki67染色、CCK-8实验及克隆形成实验结果表明NFATc1敲除后两种乳腺癌细胞系的增殖能力明显下降(P<0.05)。免疫印迹结果揭示,NFATc1敲除能够明显抑制癌细胞中RhoA/ROCK信号通路的激活(P<0.05)。结论:NFATc1可能通过调控RhoA/ROCK信号通路进而促进乳腺癌细胞增殖,有望成为治疗乳腺癌的新靶点。

NFATc1对裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤脉管生成的影响

目的:探讨胞浆活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells,cytplasmic 1,NFATc1)对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长和肿瘤脉管生成的影响及其可能机制。方法:NFATc1 si RNA转染人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3,免疫荧光及RT-PCR测量转染效率和基因抑制率,选取效率最高的序列建立裸鼠皮下移植瘤模型,测量各组裸鼠肿瘤体积,观察NFATc1 siRNA的体内抗肿瘤作用。免疫组织化学检测各组肿瘤组织NFATc1的表达情况,并使用细胞角蛋白染色标记上皮性来源,CD34标记微血管,podoplanin标记微淋巴管。分别计算各组微血管及微淋巴管密度并进行统计学分析。应用RT-PCR及Western blot检测各组移植瘤组织NFATc1、CXC趋化因子受体2(CXCR2)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)及血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)的mRNA及蛋白表达水平。结果:3条特异性序列均可显著降低NFATc1的表达水平,以siRNA-1169最佳。NFATc1在空白组及阴性对照组瘤组织高表达。干扰组抑瘤率为57.08%,且重量和体积均低于2个对照组。空白组和阴性对照组的微血管密度和微淋巴管密度明显高于干扰组。对照组比较,NFATc1 siRNA可以在mRNA水平上明显抑制NFATC1、CXCR2、FGF-2和PDGF-BB的转录。Western blot各组细胞在相应位置出现NFATc1、CXCR2、FGF-2和PDGF-BB条带,空白组与阴性对照组的吸光度最强,与干扰组比较具有显著差异。结论:NFATc1 siRNA明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤脉管生成,下调CXCR2、FGF-2及PDGF-BB的表达可能为其途径之一。

跑台运动通过抑制骨吸收CN/NFATc1信号通路改善慢性肾病小鼠骨代谢和骨结构

目的:通过肾部分切除手术造慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)小鼠模型,研究跑台运动对CKD小鼠骨代谢和骨结构的影响,以及对CKD小鼠骨吸收CN/NFATc1信号通路的作用。方法:4周龄30只C57BL/6雄性小鼠,随机分为CKD对照组(CKD)、CKD运动组(CKD+E)和假手术对照组(SHAM),每组10只。CKD组和CKD+E组小鼠通过肾部分切除手术造成CKD小鼠模型,SHAM小鼠行假手术作为对照;CKD+E组小鼠进行为期8周的跑台训练,末次训练24 h后处死各组小鼠。Micro-CT法检测股骨和第三腰椎骨组织形态计量学指标,ELISA法测试血清骨代谢指标,Quantitative Real-time PCR法测定股骨中CN/NFATc1信号通路相关细胞因子mRNA表达,Western Blot检测骨中Src1和NFATc1的蛋白表达。结果:与SHAM组相比,CKD组小鼠股骨和第三腰椎松质骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD显著降低(P<0.01),Tb.Sp和Po(tot)显著升高(P<0.01),血清骨形成指标OC、PICP、PINP和BALP显著降低(P<0.01),血清骨吸收指标CTX、NTX和TRACP显著升高(P<0.01),骨组织TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1、TRAP mRAN表达和Src1、NFATc1蛋白表达显著升高(P<0.01);与CKD组相比,CKD+E组小鼠股骨和第三腰椎松质骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD显著升高(P<0.05或P<0.01),Tb.Sp和Po(tot)显著降低(P<0.05或P<0.01),血清骨形成指标OC、PICP、PINP和BALP显著升高(P<0.05或P<0.01),血清骨吸收指标CTX、NTX和TRACP显著降低(P<0.05或P<0.01),骨组织TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1、TRAP mRAN表达和Src1、NFATc1蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:跑台运动通过抑制骨吸收CN/NFATc1信号通路,改善CKD小鼠骨代谢和骨结构。

NFATc1-ERK5通路介导流体剪切力促进成骨细胞BMP7表达

目的:探讨成骨细胞中NFATc1与ERK5调控关系,并研究流体剪切力(FSS)调节BMP7表达的信号通路。方法:实验分为6组,即空白组、FSS组、Cs A(Cyclosporin,NFATc1抑制剂)组、XMD8-92(ERK5抑制剂)组、FSS+Cs A组、FSS+XMD8-92组。用Western Blot方法检测不同干预条件下NFATc1、ERK5、p-ERK5以及BMP7蛋白表达水平并进行比较。结果:12 dyn/cm^2FSS作用45 min能够显著提高NFATc1、p-ERK5在成骨细胞内水平,400 nmol/L Cs A干预30 min能够有效抑制NFATc1表达量升高以及ERK5磷酸化,但5μmol/L XMD8-92作用1 h仅能够抑制ERK5磷酸化,而对NFATc1没有作用。此外,FSS促进MC3T3-E1细胞中BMP7表达量升高,Cs A和XMD8-92任何一种抑制剂均能显著阻止BMP7表达。结论:FSS在成骨细胞中通过NFATc1来调控ERK5磷酸化,BMP7为ERK5下游靶点受NFATc1-ERK5通路调控。

Fisetin经c－Fos／NFATc1信号通路抑制小鼠巨噬细胞分化为破骨细胞的研究

目的：探讨Fisetin阻断c－Fos／NFATc1信号通路对钛颗粒诱导小鼠巨噬细胞向破骨细胞分化的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264．7，根据处理条件不同分为5组：A组（空白对照组）、B组（钛颗粒对照组）、C组（1．25μmol／L Fisetin＋钛颗粒）、D组（2．5μmol／L Fisetin＋钛颗粒）、E组（5μmol／L Fisetin＋钛颗粒）。采用CCK－8法检测各组RAW264．7细胞增殖活性。培养6天后，抗酒石酸酸性磷酸酶（ TRAP）染色检测各组细胞破骨细胞（细胞核≥3）数目，免疫印迹法检测各组细胞中c－Fos／NFATcl蛋白表达，RT－PCR法检测c－Fos／NFATc1的基因表达。结果 CCK－8法检测结果显示各组RAW264．7细胞增殖能力差异无统计学意义（P＞0．05）。 TRAP染色结果显示各组细胞均有TRAP阳性多核细胞生成，B组TRAP阳性多核细胞数目最高，C、D、E组呈现逐渐减少趋势，A组最少。 RT－PCR和Western blot检测表明，B组c－Fos／NFATc1表达最高，C、D、E组表达逐渐减少，与B组比较差异具有统计学意义（ P＜0．05）。结论 Fisetin可通过c－Fos／NFATc1信号通路抑制钛颗粒作用下小鼠巨噬细胞向破骨细胞的分化，其抑制程度与Fisetin药物浓度有关。

Sos2抑制NFATc1介导的糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究

目的:观察高糖刺激对体外培养的小鼠肾足细胞鸟苷酸交换因子Sos2(Son of Sevenless homolog2)表达的影响,并初步探讨Sos2在高糖诱导足细胞损伤中的作用及其可能的分子机制。方法:通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察Sos2在糖尿病肾病患者足细胞中的表达;体外培养小鼠永生化足细胞,以高糖(30 mmol/L葡萄糖)刺激足细胞48 h,采用RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测高糖刺激下足细胞Sos2的mRNA及蛋白表达;采用Western bolt实验、免疫荧光及划痕实验检测Sos2过表达及沉默后podocin的表达、足细胞的活动性及NFATc1的入核情况;并采用RT-PCR检测NFATc1下游目的基因转录情况。结果:Sos2在糖尿病肾病患者的足细胞及高糖刺激体外培养的足细胞中表达显著降低(P <0. 05);沉默Sos2后,足细胞标志蛋白podocin表达显著降低,足细胞活动性增加,NFATc1入核增加,NFATc1下游目的基因转录增加(P <0. 05);与之相反,过表达Sos2组podocin表达显著增高,足细胞的活动性降低,NFATc1的入核减少,NFATc1下游目的基因转录降低(P <0. 05)。结论:Sos2可能通过抑制NFATc1入核而减轻糖尿病肾病足细胞损伤。

IL-38通过调控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路抑制骨质疏松的机制研究

目的:探讨IL-38抑制骨质疏松的作用并研究其分子机制。方法:共纳入2014年6月~2016年12月我院收治的138例骨质疏松患者作为研究对象。另选取120例同期在我院骨科进行骨折手术的无骨质疏松患者作为对照。采用ELISA法检测实验对象血清IL-38水平。构建IL-38-C57BL/6J转基因小鼠,建立骨质疏松小鼠模型,将野生型、IL-38转基因小鼠分别设置为假手术组(Sham组)与卵巢切除组(Ovariectomy,OVX组)。术后8周取小鼠血清,检测碱性磷酸酶(ALP)、血钙及血磷水平。另取小鼠的脊柱与双侧股骨,通过病理切片分析股骨组织形态结构,用骨密度仪检测脊柱骨密度变化。将各组小鼠的骨髓基质细胞(BMSCs)进行分离并检测其体外增殖能力,Western blot检测各组BMSCs的PI3K、Akt、GSK3β与NFATc1的磷酸化水平。小鼠成骨细胞MC3T3-E1转染IL-38后,Western blot检测PI3K、Akt、GSK3β与NFATc1磷酸化水平的变化,流式细胞术检测IL-38对细胞凋亡的影响。结果:骨质疏松组患者的血清IL-38水平显著低于对照组(P<0.05)。野生型与IL-38转基因OVX小鼠的血钙、血磷水平均显著高于Sham组(P<0.05),而ALP水平显著低于Sham组(P<0.05)。另外,IL-38转基因OVX小鼠的血钙和血磷水平均显著低于野生型OVX小鼠(P<0.05)。股骨病理切片及脊柱骨密度分析显示,野生型与IL-38转基因OVX小鼠均出现骨组织形态结构破坏和骨密度下降,并且IL-38转基因OVX小鼠的骨组织形态结构破坏和骨密度下降情况均较野生型OVX小鼠显著减轻(P<0.05)。IL-38转基因OVX小鼠BMSCs的体外增殖能力显著高于野生型OVX组(P<0.05)。IL-38转基因OVX小鼠BMSCs的PI3K、Akt与NFATc1磷酸化水平均显著低于野生型OVX组(P<0.05),GSK3β磷酸化水平显著高于野生型OVX组(P<0.05)。MC3T3-E1细胞转染IL-38后PI3K、Akt与NFATc1的磷酸化水平均显著降低(P<0.05),GSK3β的磷酸化水平显著升高(P<0.05)。流式细胞检测显示转染IL-38后MC3T3-E1细胞的凋亡显著减少(P<0.05)。结论:骨质疏松患者的血清IL-38水平显著降低,IL-38可能通过调控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路促进BMSCs增殖、抑制成骨细胞凋亡,从而抑制骨质疏松的进展。

蛇床子素对NFATc1基因表达及破骨细胞分化的影响

目的研究蛇床子素(osthole,OST)对破骨细胞形成和骨吸收的影响,并初步分析其分子机制。方法体外构建破骨细胞诱导培养体系,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)法、骨吸收陷窝扫描电镜观察鉴定成熟破骨细胞,采用CCK-8 (cell counting kit-8)法筛选无细胞毒性的药物浓度组,使用细胞骨架荧光染色法观察OST对其形态的影响。使用骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色进行面积定量分析,并统计吖啶橙荧光染色后凋亡破骨细胞的比例,采用荧光定量PCR法测定OST对NFATc1等相关破骨基因表达的影响。结果体外成功构建破骨细胞培养体系,通过CCK-8法筛选出10-6、10-5mol/L两组药物浓度。OST可使破骨细胞肌动蛋白环变细,伪足和褶皱区消失。OST 0、10-6、10-5mol/L组TRAP染色阳性数目分别为104. 6±4. 5、80. 4±3. 7、58. 2±3. 1,融合指数分别为(44. 3±3. 3)%、(20. 3±0. 9)%、(12. 6±0. 6)%,各浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P<0. 05);该3组诱导的破骨细胞产生的骨陷窝数目为41. 67±1. 16、34. 01±2. 65、26. 33±4. 16,骨陷窝面积(μm2/片)分别为1 445 942. 0±164 150. 0、904 080. 8±47 346. 0、641 049. 1±1 993. 0,各浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P<0. 05);该三组破骨细胞凋亡率分别为:26. 3%、30. 1%、37. 2%,OST组凋亡率较对照组明显升高,且差异有统计学意义(P<0. 05),但两浓度组之间差异无统计学意义(P> 0. 05)。RANKL诱导后NFATc1、CTSK、MMP-9、TRAP、INTE-BETA3、C-SRC的mRNA表达量分别为空白组的2. 147±0. 246、30. 5±1. 643、43. 54±2. 908、9. 116±0. 392、6. 664±0. 395、4. 131±0. 408倍,与空白组相比表达量均明显升高,差异具有统计学意义(P<0. 01);OST干预后,各组表达量均受到明显抑制,OST组表达量与RANKL对照组相比差异也均具有统计学意义(P<0. 05)。除了NFATc1外,两浓度组组间比较,差异均有统计学意义(P <0. 05)。结论 OST可以通过调控NFATc1等破骨基因表达抑制破骨细胞的分化。

苦参碱对RANKL诱导破骨细胞分化及TRAF6、c-fos、NFATc1表达水平的影响

目的探讨苦参碱对RANKL诱导破骨细胞分化的影响及其可能的分子学机制。方法 RAW264.7细胞系培养,根据加入破骨细胞诱导剂RANKL及不同剂量苦参碱,分为空白组、诱导组、苦参碱低剂量组(0.5 mg/mL)、苦参碱中剂量组(1 mg/mL)、苦参碱高剂量组(2 mg/mL)。给药后48 h,qPCR、Western blot检测TRAF6、c-fos、NFATc1 m RNA及蛋白的表达,第7天TRAP染色观察多核破骨细胞,第9天qPCR检测Calcr、Ctsk mRNA表达,第12天甲苯胺蓝染色观察骨吸收陷窝。结果不同剂量苦参碱组中多核破骨细胞、骨吸收陷窝、Calcr mRNA、Ctsk m RNA表达量较诱导组减少。苦参碱不同剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表达量较诱导组明显下降(P <0.01),且呈剂量依赖性。空白组与苦参碱高剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表达量比较差异无统计学意义(P> 0.05)。与诱导组比较,苦参碱低、中、高剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1蛋白表达量下降(P <0.05),且呈剂量依赖性。空白组与苦参碱高剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1蛋白表达量比较差异无统计学意义(P> 0.05)。结论苦参碱可能通过抑制TRAF6、c-fos、NFATc1的表达,影响RANKL诱导破骨细胞的分化。

NFATc1对糖尿病动脉粥样硬化ApoE^(-/-)小鼠肠道菌群的影响

目的:探究活化T细胞核因子胞浆1型(nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1,NFATc1)对糖尿病动脉粥样硬化ApoE^(-/-)小鼠肠道菌群的影响。方法:通过链脲佐菌素诱导ApoE^(-/-)小鼠,构建糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型,尾静脉注射腺相关病毒干扰体内NFATc1的表达。8周后处死小鼠,取其主动脉组织进行蛋白质印迹,验证NFATc1在主动脉中的敲减情况;通过HE染色分析主动脉粥样硬化斑块的相对面积。收集小鼠粪便,进行Illumina MiSeq测序,通过生物信息学分析小鼠肠道菌群纲水平的变化。结果:成功构建糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型,尾静脉注射NFATc1敲减腺相关病毒后,其主动脉内NFATc1表达显著减少(P<0.05)。HE染色显示主动脉有明显的粥样斑块形成,相较于阴性对照组,干扰NFATc1表达后斑块相对面积显著减小(P<0.05)。16S rRNA基因测序结果显示,敲减NFATc1小鼠肠道内产芽胞菌纲的相对丰度(78.82%)较阴性对照组小鼠(32.93%)明显升高(W值=2)。结论:NFATc1可改变糖尿病动脉粥样硬化ApoE^(-/-)小鼠肠道菌群的相对丰度。

NFATc1对人肺腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响

目的探究NFATc1对肺腺癌NCI-H1299细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,以及NFATc1发挥作用的生物学机制。方法通过Realtime PCR检测NFATc1在三种肺腺癌细胞系中的相对表达水平,利用慢病毒载体构建稳定敲减NFATc1的NCI-H1299细胞系。MTT检测NFATc1对细胞增殖能力的影响,平板克隆形成实验检测NFATc1对克隆形成能力的影响,Transwell检测NFATc1对细胞迁移和侵袭能力的影响,流式细胞术检测NFATc1对细胞周期和凋亡的影响,Western blot检测NFATc1对凋亡、EMT相关蛋白和MAPK信号通路蛋白表达的影响。结果肺腺癌NCI-H1299细胞系中NFATc1表达水平相对较高。沉默NFATc1表达可以显著抑制细胞增殖(P<0.05)、克隆形成(P<0.05)、迁移(P<0.05)和侵袭(P<0.05)能力,抑制细胞周期在G1期(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05)。Bax、Cleaved caspase-3和E-Cadherin蛋白表达增加(P<0.05),CDK4、c-Myc、ERK、p-ERK和N-Cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。结论在人肺腺癌NCI-H1299细胞中抑制NFATc1表达,可以显著抑制细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡,其机制可能与抑制MAPK信号通路相关。

云南白药对LPS诱导小鼠头颅骨炎症模型NF-κ B和NFATc1的影响

目的建立LPS诱导小鼠头颅骨炎症模型,评价云南白药对NF-κB和NFATc1表达的影响作用。方法选用健康雄性昆明小鼠90只,随机分成3组:正常组(30只)、模型组(30只)、云南白药组(30只)。模型组和云南白药组脂多糖(LPS)诱导头颅骨炎症模型,云南白药组在建模的当天开始给予云南白药灌胃,于3d、5d、8d各分组处死10只。收集小鼠头颅骨行TRAP染色检测破骨细胞的数量以及WesternBlot检测NF-κB和NFATc1。结果TRAP染色结果显示云南白药能明显抑制破骨细胞的形成。Western-bolt检测结果显示在各个时间点模型组NF-κB和NFATc1表达水平均高于正常组(P<0.05)和云南白药组(P<0.05),仅在第8天云南白药组NF-κB表达水平高于正常组(P<0.05)。结论云南白药可以明显抑制LPS诱导的炎症中破骨细胞形成,以及破骨细胞的形成相关因子NF-κB、和NFATc1的表达。

过表达miR-25通过NFATc1信号通路调控钛颗粒诱导的破骨细胞分化

背景:研究发现miR-25的下调与活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)过度激活相关,而NFATc1是破骨细胞分化成熟中的核心转录因子,提示miR-25的表达水平能调控破骨细胞分化。目的:探讨过表达miR-25对Ti颗粒诱导的破骨细胞分化的影响,并探索其中的信号通路。方法:体外培养RAW264.7细胞系,CCK-8测定Ti颗粒对细胞增殖的影响;转染miR-25模拟物(mimics)至RAW264.7细胞,并与Ti颗粒培养诱导破骨细胞的分化;免疫荧光检测NFATc1的激活状态,TRAP染色及计数验证各组破骨细胞分化情况,实时荧光定量PCR检测Ca2+/NFATc1通路分子NFATc1、CaMKⅡ、CaMKⅣmRNA表达。结果与结论:(1)低浓度的Ti颗粒(0.1 g/L)对细胞增殖无明显影响;(2)与阴性对照组相比,miR-25过表达组破骨细胞(TRAP阳性细胞)生成明显减少(P <0.05);(3)细胞内转染miR-25模拟物后,免疫荧光检测见NFATc1的激活减少,荧光强度降低;(4)miR-25过表达后信号通路分子NFATc1、CaMKⅡ、CaMKⅣmRNA的表达显著下降(P <0.05)。(5)结果表明,miR-25过表达能抑制Ti颗粒诱导的破骨细胞分化,这一过程可能是通过Ca2+/NFATc1通路实现的。