siRNA介导的NFBD1表达沉默对HeLa细胞增殖与凋亡的影响

NFBD1,也称MDC1,是1个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为探讨NFBD1在细胞增殖和凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究采用siRNA技术抑制NFBD1的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响.半定量RT-PCR和蛋白质印迹分析结果表明,筛选到的短链NFBD1 siRNA能有效抑制内源NFBD1的表达,抑制程度约100%.细胞生长曲线分析结果表明,siRNA介导的NFBD1表达沉默导致HeLa细胞生长增殖的显著抑制.FACS分析结果表明,NFBD1表达抑制导致sub-G1峰的出现,同时蛋白质印迹分析观察到了caspase 3和PARP(poly-ADP-ribose polymerase)的剪接激活,表明NFBD1表达抑制诱发了细胞凋亡.在该凋亡过程中,P53及其下游靶分子Bax和Puma的表达水平均没有发生明显变化,但Noxa的表达在mRNA和蛋白质水平上均显著上调,强烈提示该凋亡过程很可能是1个不依赖P53的凋亡途径,且Noxa的转录激活在该凋亡过程中可能起着重要作用.这些结果表明,NFBD1参与细胞生长增殖和凋亡的调节,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.

一个新的人NFBD1启动子的鉴定与分析

目的:鉴定分析NFBD1启动子,为进一步研究其转录调控奠定基础.方法:综合应用生物信息学分析和异构体特异性的巢式RT-PCR技术鉴定NFBD1转录起始位点和转录变异体;高保真PCR方法扩增NFBD1基因启动子区域并分别定向克隆入pGL3-basic和pGL3-enhancer载体,构建NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体;荧光素酶分析检测启动子活性;生物信息学方法预测转录因子结合位点.结果:鉴定了一个新的NFBD1转录起始位点和转录变异体,构建了2个含有长度分别为2.5和1.2kb的NFBD1启动子序列的荧光素酶报告基因重组体以及2个相应的含有外源增强子的NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,该启动子区域具有启动子活性,且能被外源增强子有效驱动,是一个新的人NFBD1启动子.转录因子结合位点预测分析表明,该启动子区域缺乏典型的CCAAT盒和GC盒,但含有TA-TA盒以及STAT1,MZF1和MAZ等潜在的转录因子结合位点.结论:鉴定了一个新的NFBD1启动子.

NFBD1在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:研究NFBD1在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化检测40例NPC组织及20例慢性鼻咽炎组织中NFBD1蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测34例NPC组织和23例慢性鼻咽炎组织中NFBD1 mRNA的表达并分析其与患者性别、年龄、颈淋巴结转移和临床分期的相关性。结果:NPC组织中NFBD1在蛋白水平(χ2=9.600,P=0.002)和mRNA水平(t=3.206,P=0.002)表达均高于慢性鼻咽炎组织,NFBD1在mRNA水平的表达高低与患者的性别(t=0.937,P=0.356)、年龄(t=0.382,P=0.698)及是否伴有临床颈淋巴结转移(t=1.037,P=0.322)、临床分期(t=0.293,P=0.771)均没有相关性。结论:NFBD1可能参与了NPC的发生,但其与NPC的侵袭转移没有明显联系。

人NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR的定点突变分析

目的对NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR进行定点突变分析,以分析CHR在NFBD1转录调控中的作用。方法以原有NFBD1核心启动子荧光素酶报告基因重组体NFBD1-PS1-325为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术对NFBD1启动子区域中的CHR位点进行定点突变,构建相应的CHR定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性,分析CHR定点突变对NFBD1启动子活性的影响;结合阿霉素处理,分析CHR在DNA损伤后NFBD1转录下调中的潜在作用。结果CHR定点突变后能显著降低NFBD1的启动子活性;CHR定点突变后显著减弱了DNA损伤后NFBD1的转录下调比例。结论CHR参与NFBD1的基础转录调控及DNA损伤后的转录下调。

抑制NFBD1表达对喉癌放化疗敏感度影响的研究

目的研究抑制NFBD1基因表达后,对喉癌细胞放化疗敏感度的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰(RNAi)技术稳定下调人喉癌细胞Hep-2中NFBD1基因的表达,采用实时定量聚合酶链反应(QRTPCR)技术及Western印迹技术检测NFBD1基因mRNA和蛋白的表达,以验证RNAi的有效性。采用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,采用MTT比色法观察抑制NFBD1基因表达后对喉癌细胞放化疗后生长的影响。TUNEL检测细胞的凋亡情况。结果 QRT-PCR及Western印迹分析表明,慢病毒感染RNAi技术在mRNA及蛋白水平均能高效、特异地抑制NFBD1基因的表达;TUNEL染色结果显示,转染NFBD1 siRNA的Hep-2细胞其凋亡率显著增加。流式细胞术结果显示,转染NFBD1 siRNA的Hep-2细胞在放疗后的凋亡率及G2/M期阻滞显著增加。MTT比色结果显示,转染NFBD1 siRNA的Hep-2细胞在放化疗后的细胞存活率显著降低。结论重组的慢病毒NFBD1 siRNA序列能有效抑制NFBD1基因的表达,从而增加喉癌细胞的放化疗敏感度。

NFBD1的生物学作用

NFBD1是一个参与DNA损伤应答的重要分子,在DNA损伤关卡、DNA损伤修复、细胞生长增殖及肿瘤发生中均有作用。研究NFBD1功能及其作用机制对生物医学基础知识的拓展以及肿瘤的防治将产生重要影响。

抑制NFBD1的表达对鼻咽癌化疗敏感性的影响

目的:研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞化疗敏感性的影响。方法:将NFBD1 siRNA导入NPC细胞系,采用RT-PCR和蛋白质印记法检测siRNA对NPC细胞NFBD1表达的抑制效果;NFBD1 siRNA转染后,MTT法分析NPC细胞对化疗药物敏感性的影响。结果:NFBD1 siRNA转染NPC细胞后,能高效、特异地在mRNA水平及蛋白质水平抑制NFBD1的表达;MTT结果分析表明,NFBD1 siRNA转染后,能显著提高NPC细胞系对化疗药物的敏感性。结论:NFBD1 siRNA转染后抑制NPC NFBD1表达,可显著提高其对化疗药物顺铂的敏感性。

人NFBD1启动子的鉴定与初步分析

NFBD1,也称MDC1,是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为了进一步深入研究其转录调控机制,本研究克隆鉴定了NFBD1的启动子.首先应用5′RACE技术鉴定了NFBD1的转录起始位点,首次发现NFBD1至少存在3种丰度和转录起始位点不同的转录变异体.然后,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了覆盖NFBD1基因5′侧翼区起始密码子ATG上游5kb区域的一系列NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,NFBD1启动子区域定位于主要转录起始位点区域附近1.5kb的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,NFBD1启动子缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和NF-Y等转录因子可能参与NFBD1的转录调控.

携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响。将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1mRNA和蛋白表达的变化。重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblot-ting检测人NFBD1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础。

沉默NFBD1表达对鼻咽癌细胞凋亡的影响

目的:研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞株HNE-1凋亡的影响。方法:用NFBD1shRNA慢病毒感染HNE-1,采用real-time PCR和Western blot检测NFBD1 shRNA慢病毒对NFBD1的抑制效果;Hoechst33342染色观察细胞核的改变并结合流式细胞仪(flow cytometry,FCM),TUNEL法检测细胞的凋亡情况。结果:NFBD1 shRNA慢病毒在mRNA和蛋白质水平均能高效、特异性地抑制NFBD1的表达;Hoechst33342染色结果显示,在NFBD1下调组,呈现固缩且边缘化的细胞核数量明显增加(χ2=5.367;P=0.021);TUNEL染色结果显示,在NFBD1下调组,显现荧光的凋亡细胞明显增加,FCM检测结果显示,在NFBD1下调组,细胞凋亡率明显增加(χ2=326.86;P<0.001)。结论:抑制NFBD1基因的表达后,能有效促进HNE-1凋亡,这为寻求NPC的治疗靶点提供新的思路。

siRNA抑制NFBD1基因表达对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:研究siRNA抑制NFBD1基因表达对人肝癌HepG2细胞凋亡的作用原理及caspase途径在此过程中的作用。方法:应用流式细胞法及RT-PCR检测沉默NFBD1对人肝癌HepG2细胞凋亡及凋亡基因组表达水平的影响。MTT法检测NFBD1 siRNA对HepG2细胞的抑制作用。结果:转染48 h后,转染组与阴性对照组和空白组相比,NFBD1mRNA表达明显减弱,转染组NFBD1 mRNA较空白组相对下降74.75%;HepG2细胞组中促凋亡基因Bc1-xl表达减少,Bid及caspase-3表达量增加(P<0.05)。MTT结果显示NFBD1 siRNA能明显抑制HepG2细胞增殖,抑制率达到92.131±0.893%。流式法检测结果显示转染组细胞凋亡明显高于阴性对照组和空白组。结论:NFBD1可通过改变Bc1-xl/Bid的表达比,激活caspase-3来诱导HepG2细胞凋亡。