抑制NFBD1表达对喉癌放化疗敏感度影响的研究

目的研究抑制NFBD1基因表达后,对喉癌细胞放化疗敏感度的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰(RNAi)技术稳定下调人喉癌细胞Hep-2中NFBD1基因的表达,采用实时定量聚合酶链反应(QRTPCR)技术及Western印迹技术检测NFBD1基因mRNA和蛋白的表达,以验证RNAi的有效性。采用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,采用MTT比色法观察抑制NFBD1基因表达后对喉癌细胞放化疗后生长的影响。TUNEL检测细胞的凋亡情况。结果 QRT-PCR及Western印迹分析表明,慢病毒感染RNAi技术在mRNA及蛋白水平均能高效、特异地抑制NFBD1基因的表达;TUNEL染色结果显示,转染NFBD1 siRNA的Hep-2细胞其凋亡率显著增加。流式细胞术结果显示,转染NFBD1 siRNA的Hep-2细胞在放疗后的凋亡率及G2/M期阻滞显著增加。MTT比色结果显示,转染NFBD1 siRNA的Hep-2细胞在放化疗后的细胞存活率显著降低。结论重组的慢病毒NFBD1 siRNA序列能有效抑制NFBD1基因的表达,从而增加喉癌细胞的放化疗敏感度。

携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响。将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1mRNA和蛋白表达的变化。重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblot-ting检测人NFBD1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础。