核转录因子-κB在子宫颈癌中的表达及其临床意义

目的:探讨核转录因子(NF)-κB在宫颈癌发生、进展过程中的作用及临床意义。方法:应用免疫组织化学S-P染色法检测42例宫颈癌组织、20例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及10例正常宫颈中NF-κB的表达情况并进行比较分析,同时研究宫颈癌患者NF-κB的表达情况与临床病理特征的关系。结果:宫颈癌组织中NF-κB蛋白阳性表达率为74.1%(30/42),CIN组织中NF-κB蛋白阳性表达率为15%(3/20),正常组织中则无NF-κB表达,宫颈癌中NF-κB阳性表达率高于CIN与正常宫颈组织(P<0.05);CIN中NF-κB阳性表达率与正常宫颈组织间差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄及组织学类型的宫颈癌患者的NF-κB阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。NF-κB不仅高表达于低分化宫颈癌,而且随着临床分期增高、出现淋巴转移,其表达增强(P<0.05)。结论:NF-κB异常表达可能是子宫颈癌发生、进展过程中的重要机制之一。

经NF-κB通路调节骨桥蛋白表达对骨关节炎滑膜细胞炎症影响

目的探讨经核因子kappa B(NF-κB)通路调节骨桥蛋白(OPN)表达对人膝关节滑膜炎的影响。方法收集20例原发性膝关节骨关节炎(OA)病人滑膜标本(OA组),以因膝关节内骨折行急症手术、半月板或韧带损伤3d内手术病人滑膜标本15例作为对照组。采用免疫组化法观察两组膝关节滑膜中OPN及NF-κB通路相关蛋白的表达;体外分离培养获取成纤维滑膜细胞,采用Western blot方法检测膝关节成纤维滑膜细胞中OPN及NF-κB通路中p65、磷酸化p65(p-p65)、IκBα和磷酸化IκBα(p-IκBα)的表达。结果与对照组比较,OA组滑膜炎症明显。免疫组化显示,OA组滑膜组织中OPN表达明显高于对照组,NF-κB信号通路激活,差异有统计学意义(t=4.796~16.980,P<0.05)。Western blot检测显示,OA组成纤维滑膜细胞中OPN、p65、p-p65、p-IκBα表达较对照组显著增加,差异有统计学意义(t=3.351~16.980,P<0.05);而两组通路抑制蛋白IκBα表达差异无显著性(P>0.05)。结论 OA滑膜增生与炎症可能与NF-κB信号通路激活介导的OPN的表达有关。

紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制研究

目的:探讨紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制。方法:①分析紫菀酮对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)染色,统计各组破骨细胞数;②分析紫菀酮对Raw 264.7细胞活力的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮的完全培养基,分别培养48 h、120 h后测定各组细胞活力;③分析紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后采用鬼笔环肽和4’,6二脒基2苯基吲哚染色,观察各组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成情况。④分析紫菀酮对核因子κB(nuclear factorκB,NFκB)转录活性的影响。将稳定转染pGL4.32[luc2P/NFκBRE/Hygro]载体的RAW 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组及阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基;培养2 h后,阳性对照组及紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入RANKL溶液,使培养基中RANKL的终浓度为25 ng·mL^(-1);继续培养6 h后,检测各组细胞荧光素酶的荧光强度。⑤分析紫菀酮对核因子κB抑制蛋白激酶α亚基(inhibitor of nuclear factor kappaB kinase subunitα,IκBα)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,每组6孔,分别编号1~6。待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基,继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1),在1号孔加入RANKL溶液后30 min、40 min、50 min、55 min,分别在2号、3号、4号、5号孔加入RANKL溶液至RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1)。在1号孔加入RANKL后60 min,收集各孔细胞,采用蛋白印迹法检测IκBα蛋白的表达量。⑥分析紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组。阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮和25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后,收集各组细胞,采用实时定量PCR检测组织蛋白酶K、空泡型ATP酶d2亚基(vacuolar ATPase subsnit D2,VATPase d2)、TRAP的mRNA表达量。⑦分析紫菀酮对活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,每组4孔,分别编号1~4。待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基。继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1),在1号孔加入RANKL溶液后2 d、4 d,分别在2号、3号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1)。在1号孔加入RNAKL后5 d,收集各孔细胞。采用蛋白印迹法检测NFATc1蛋白的表达量。结果:①紫菀酮对RANKL诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析结果。空白对照组之外的5组破骨细胞数比较,差异有统计学意义[(187.667±14.503)个,(180.000±14.422)个,(174.333±11.060)个,(152.667±5.033)个,(130.667±11.015)个,F=11.767,P=0.001]。紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组破骨细胞数均少于阳性对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组(P=0.004,P=0.000;P=0.017,P=0.000;P=0.047,P=0.001);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞数少于紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组(P=0.044)。②紫菀酮对Raw 264.7细胞活力影响的分析结果。紫菀酮干预48 h、120 h时,5组Raw 264.7细胞活力比较,组间差异均无统计学意义(48 h:0.960±0.101,0.938±0.051,0.916±0.072,0.915±0.079,1.009±0.105,F=0.647,P=0.641;120 h:1.347±0.161,1.388±0.047,1.423±0.473,1.398±0.067,1.357±0.034,F=0.400,P=0.805)。③紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成影响的分析结果。与空白对照组比较,阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组均可见破骨细胞和纤维状肌动蛋白环;与阳性对照组比较,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成均受到抑制,且其受到抑制的程度随紫菀酮干预浓度增加而增强。④紫菀酮对破骨细胞NFκB转录活性影响的分析结果。3组荧光素酶相对荧光强度比较,组间差异有统计学意义(0.058±0.003,1.000±0.044,0.753±0.040,F=613.132,P=0.000)。阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组的荧光素酶相对荧光强度高于空白对照组(P=0.000,P=0.000),紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组的荧光素酶荧光强度低于阳性对照组(P=0.000)。⑤紫菀酮对IκBα蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈先下降后上升趋势,但2组的趋势不完全一致(1.000±0.000,0.414±0.171,0.285±0.104,0.132±0.021,0.157±0.038,0.802±0.066,F=49.839,P=0.000;0.980±0.130,0.632±0.102,0.347±0.037,0.302±0.070,0.546±0.142,1.502±0.345,F=21.435,P=0.000);诱导20 min、30 min、60 min,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量高于阳性对照组(t=-4.018,P=0.016;t=-4.586,P=0.010;t=-3.444,P=0.026)。⑥紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录影响的分析结果。3组破骨细胞VATPased2、组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量比较,组间差异均有统计学意义(1.000±0.089,0.879±0.100,0.530±0.054,F=25.553,P=0.001;1.000±0.030,0.725±0.153,0.719±0.111,F=6.293,P=0.034;1.000±0.326,0.834±0.030,0.656±0.327,F=88.003,P=0.000)。紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组破骨细胞组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量均低于阳性对照组(P=0.023,P=0.001);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞VATPased2、TRAP的mRNA表达量均低于紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和阳性对照组(P=0.000,P=0.002;P=0.000,P=0.000);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞组织蛋白酶K的mRNA表达量低于阳性对照组(P=0.021)。⑦紫菀酮对NFATc1蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈上升趋势,但2组的上升趋势不完全一致(1.000±0.000,1.175±0.007,4.700±0.742,19.430±1.763,F=250.352,P=0.000;1.042±0.035,1.334±0.290,3.531±0.583,15.690±0.823,F=525.669,P=0.000);诱导后5 d,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量低于阳性对照组(t=3.329,P=0.029)。结论:紫菀酮能够抑制体外破骨细胞的分化和活性,其作用机制与抑制NFκB和NFATc1信号通路有关。

芦荟提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠的梗死面积及TNF-α、NF-κB的影响

目的观察芦荟提取物对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用以及对TNF-α和NF-κB的影响来进一步探讨其作用机制。方法雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、缺血再灌注组、芦荟提取物低、中、高剂量组和阳性对照组,脑缺血2h后再灌注24h时断头处死大鼠,采用Longa评分法,观察脑梗死模型大鼠的活动情况,一部分进行TTC染色和HE染色观察脑梗死体积及病理形态学变化;另一部分采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法、RT-PCR及凝胶电泳技术检测TNF-α和NF-κB的含量及表达。结果芦荟提取物能明显改善模型大鼠神经功能缺损的症状和脑缺血组织的病理形态学,降低TNF-α和NF-κB的含量及其基因表达水平。结论芦荟提取物对实验大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的脑血管保护作用,其机理与抑制相关炎症因子的表达水平有关。