NGAL基因对结直肠恶性肿瘤影响的Meta分析

目的NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin)作为lipocalin家族成员中的一位,最开始是在人中性粒细胞中被研究发现的,与基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)活性有紧密的相关性。在许多正常组织细胞中,均有NGAL的表达,但在很多恶性肿瘤的演变过程中出现异常表达。本研究应用Meta分析方法系统评价NGAL对结直肠癌的影响。方法检索PubMed、Embase、中国知网、万方、维普等数据库中采用免疫组化研究方法探究NGAL与结直肠癌表达关系的研究文献,95%置信区间(CI)和优势比(OR)作为效应指标,应用RevMan5.4软件对符合标准的纳入文献结果进行Meta分析。结果根据纳入及排除标准最终纳入5篇符合标准的文献,Meta分析显示:NGAL基因在结直肠中与对应的癌和癌旁组织中存在差异表达(OR=16.01,95%CI 9.85~26.02,P<0.01),有无淋巴结转移中NGAL基因差异表达(OR=2.75,95%CI 1.69~4.47,P<0.01),不同分化程度中NGAL差异表达(OR=2.81,95%CI 1.44~5.48,P<0.01),在肿瘤分期中差异表达(OR=4.05,95%CI 2.30~7.16,P<0.01)。结论NGAL与结直肠癌发生发展过程存在相关性,在结直肠癌的诊治、预防与评估中有一定价值。

反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架的影响

为了研究反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架以及肿瘤细胞生物学行为的影响 ,以不同长度NGAL基因片段反义表达载体和硫代修饰反义寡核苷酸单链片段转染SHEEC食管癌细胞 ,通过G4 18筛选 ,建立一系列旨在封闭SHEEC食管癌细胞NGAL基因表达的亚细胞克隆 .在细胞内F 肌动蛋白 (F actin)及DNA荧光双标记基础上 ,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜扫描术等技术手段检测封闭反义NGAL基因表达后 ,SHEEC食管癌细胞中F actin和DNA含量、F actin形态结构以及肿瘤细胞生物学行为的变化特征 .结果显示 ,反义封闭NGAL基因表达后 ,SHEEC食管癌细胞F actin的含量明显降低 ,与永生化食管上皮细胞SHEE相近 ,但细胞分裂增殖指数未见明显变化 .表明反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架有明显影响 ,而对SHEEC食管癌细胞的分裂增殖影响不明显 .激光共聚焦显微镜扫描观测显示 ,反义封闭NGAL基因表达可使SHEEC食管癌细胞F actin分布均匀 ,F actin小体减少 ,细胞间连接重新建立 ,结构较紧密 ,主要形态结构特征与SHEE细胞趋于一致 .提示反义封闭NGAL基因表达可对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架F actin产生明显影响 ,推测癌细胞的微丝骨架F

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和

NGAL的结构与功能研究进展

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin）是一种新的lipocalin,其结构与功能的研究进展为人瞩目。目前认为 ＮＧＡＬ具有运输疏水性小分子，调节明胶酶B(gelatinase B或matrixmetalloproteinase-9,ＭＭＰ－９）活性等功能，并可能参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的浸润转移等过程。最近，ＮＧＡＬ蛋白的空间结构已被研究清楚。这对于促进ＮＧＡＬ生物学作用或功能的研究，特别是对其新的生物学作用或功能的探索，比如与肿瘤的关系（ＮＧＡＬ可能是一种新的癌基因或促癌基因）将具有十分重要的意义。对此作者进行了综合评述。

NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定

背景与目的:构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5’侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431-+84)。PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic。重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定。结果:成功构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-G0-G6。结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5’侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件。

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的 :从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因 5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法 :采用PCR法克隆NGAL基因 5′端转录调控区 ,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果 :从SHEEC中获得了NGAL基因 5′端转录调控区 - 112 4～ +6 5区段的克隆 ,该区段序列有 3处点突变 ,在NGAL基因- 112 4～ +6 5区段共鉴定出 78个有效顺式作用元件位点。结论

NGAL基因不同长度片段的克隆及其顺式作用元件定位分析

NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)是lipocalin家族的一个新成员,可能是人类的一种新癌基因,但其在肿瘤中的表达调控机制尚不清楚。应用生物信息学手段对NGAL(X99133,包括外显子和内含子)进行分析发现,此区域内含有许多潜在的顺式作用元件,其中主要为增强子元件。对此设计了以下实验:应用PCR技术从食管癌细胞SHEEC基因组DNA中扩增不同长度的NGAL基因片段,将其连接到PGEMT-eacy载体中进行扩增,并测序。NCBI/BLAST分析确认扩增片段为NGAL基因所有,与实验所设计相吻合。在此基础上并应用KEGG/MOTIF检索分析系统对NGAL基因的上述区段进行了顺式作用元件定位分析,结果共鉴定出5个Score值=100分的顺式作用元件位点。这为NGAL基因增强子的鉴定提供了新线索。

NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的研究

以往研究发现, 食管癌细胞的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)基因的过表达具有明显的 12-O- 十四烷酰佛波醇 -13- 醋酸酯(12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate, TPA)诱导性, 在启动子- 152～- 60 区段存在着一种新型的 TPA 反应元件(TPA response element, TRE), 但是该元件的结合蛋白尚未被鉴定出来. 采用寡核苷酸 DNA 亲和层析法(oligonucleotide trapping)从食管癌细胞中分离纯化了 NGAL 基因 TRE 结合蛋白; 经 SDS-PAGE进一步分离, 银染显示目标蛋白带. 人工切取各目标蛋白带进行 MALDI-TOF-MS 分析, 通过 Mascot 软件搜索 NCBI 数据库, 根据蛋白质的功能、细胞定位和分子质量大小等指标确定 8 个核蛋白因子: C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β、FAM54A、KLF15、KLF10 和 YY-1. 最后, 利用 RT-PCR 验证了这些核蛋白因子表达的 TPA 反应性, 结果表明 C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β和 KLF15 等编码基因的转录表现出了明显的 TPA 反应性, 提示可能是食管癌细胞中应答 TPA刺激, 参与 NGAL 基因过表达的转录激活因子.

NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究

为研究NGAL (neutrophilgelatinase associatedlipocalin)基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中的表达情况 ,以永生化食管上皮细胞系SHEE和食管癌细胞系SHEEC互为对照 ,用cDNA微列阵进行筛选 ,用RNA印迹和RT PCR进行鉴定 ,cDNA克隆测序后与GenBank进行BLAST分析比较 .结果表明NGAL基因在SHEEC中出现显著差异过表达 ,其cDNA序列与小鼠 2 4p3、大鼠NRL (neu relatedlipocalin)、人中性粒细胞NGAL和卵巢癌NGAL具有较高的相似性 .这提示NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用 。

食管癌细胞NGAL基因-416～+84区段存在TPA反应元件

目的本文旨在对NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件进行研究。方法(1)采用PCR法从食管癌细胞中克隆NGAL基因5′侧翼区416～+84片段,然后分别插入质粒pGLB和pGLE,构建pGLB416和pGLE416荧光素酶报告基因表达载体;(2)将pGLB416和pGLE416分别同pRLTK共转染食管癌细胞EC109;(3)用TPA刺激转染的EC109,检测细胞相对荧光素酶活力,通过相对荧光素酶活力变化判定NGAL基因5′侧翼416～+84区是否存在TPA反应元件,同时进行生物信息学分析。结果无论是pGLB416还是pGLE416,与pRLTK共转染食管癌细胞EC109后,用TPA刺激,与其相应的空载体相比,转染细胞荧光素酶活力均极显著升高(t检验,P<0.01),约分别升高46.82和46.41倍;而TPA刺激组与没有TPA刺激组相比,pGLB416和pGLE416转染EC109细胞荧光素酶活力分别显著升高了5.17倍和7.37倍(t检验,P<0.01)。生物信息学分析显示,NGAL基因5′侧翼416～+84区段至少存在4个潜在的TPA反应元件。结论食管癌细胞NGAL基因5′侧翼416～+84区段存在着TPA反应元件。

食管癌细胞NGAL5′侧翼区存在TPA应答元件

在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中,NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)过表达,提示食管癌细胞NGAL转录调控区可能存在TPA应答元件.为了对食管癌细胞NGAL的这一TPA应答元件进行分段定位鉴定,首先将NGAL5′侧翼区不同长度片段-1 431^+84-、1 137^+84、-945^+84、-657^+84、-416^+84和-152^+84等依次插入质粒pGLP,构建NGAL/pGLP系列报告基因荧光素酶表达载体pGLP-1431、pGLP-1137、pGLP-945、pGLP-657、pGLP-416和pGLP-152;然后将上述质粒分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,最后用5 ng/ml的TPA刺激转染的EC109,检测报告基因荧光素酶活力,综合判定报告基因荧光素酶活力变化趋势,并以此对食管癌细胞NGAL5′侧翼区TPA应答元件进行分段定位.实验结果表明,食管癌细胞NGAL5′侧翼-657^-417区段内存在着较强的TPA应答元件.生物信息学分析显示,NGAL5′侧翼-657^-417区段至少存在3个潜在的TPA应答元件,表明有应答TPA刺激的结构基础.这些研究有助于从分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达机制.

NGAL基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定

目的对NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)基因5′侧翼区的转录调控启动子区进行分段定位鉴定。方法将NGAL基因5’侧翼区-416^+84和-152^+84两个区段分别克隆至专门用于研究启动子的报告基因表达载体pGL3-Enhancer(pGLE)中,构建表达载体pGLE-416和pGLE-152;然后将pGLE-152和pGLE-416分别与pRL-TK载体共转染HeLa细胞、EC109细胞和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有启动子元件。结果与pGLE相比,pGLE-152在上述三种细胞中的相对荧光强度均明显增强(P<0.05),且在不同的细胞中增强的幅度明显不同。结论NGAL基因的启动子位于-152^+84区段内,启动子的强弱具有细胞特异性,这可能与增强子的协同作用相关联。

CYP2C19基因多态性检测联合血清NGAL对冠心病患者介入术后对比剂肾病的预测价值

目的通过检测CYP2C19基因多态性及血清NGAL为预测冠心病患者介入术后对比剂肾病(CIN)发生提供有效方法。方法回顾性收集南京医科大学第二附属医院2017年4月-2018年4月行冠状动脉造影或介入治疗的冠心病患者136例,按照术后是否发生CIN,将患者分为CIN组(10例),非CIN组(126例)。分别进行CPY2C19基因测序及手术前后血Cr,尿素氮与血NGAL的检测。结果 (1)CPY2C19基因多态性中快代谢基因型与中,慢代谢基因型在CIN的发生率有统计学意义(χ2=4.12,P<0.05),中,慢代谢基因型在CIN的发病率上明显高于快代谢型。(2)术后24hCIN组血Cr及NGAL水平高于术前,且高于术后24h非CIN组(t=2.798,t=19.88,P<0.05)。(3)Pearson相关分析显示,术后24h血NGAL水平分别与术后24h血Cr,BUN呈正相关(P<0.05)。(4)ROC曲线显示术后24hNGAL曲线下面积为0.915;血Cr曲线下面积为0.943,此时血NGAL检测截断点取219.15ng/ml时,尤登指数最大,此时敏感度100%,特异性70%。血清Cr截断点取97.45μmol/L时,尤登指数最大,此时敏感度90%,特异度9.5%。结论 CIN的发生与冠心病患者本身的CYP2C19基因多态性有关,血NGAL相较于血Cr可以提早预测CIN的发生。

质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响

背景与目的 :探讨影响嵌套缺失反应的重要因素 ,找出相应的解决方案。材料与方法 :以构建好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin,NGAL)基因5’端调控区质粒pGLB_G6为研究对象,采用碱裂解法、聚二乙醇纯化法及QIAGEN试剂盒等3种不同方法制备该质粒 ,分别研究ExoⅢ对它们进行非特异性切割的敏感性 ,选出对ExoⅢ不敏感的质粒制备方法 ;在22℃和37℃分别进行缺失反应 ,琼脂糖凝胶电泳监控 ,以确定缺失反应是否已经发生 ;应用PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子。 结果 :QIAGEN试剂盒制备的质粒对ExoⅢ的非特异性切割最不敏感 ,可用于进行下一步的缺失反应 ;在22℃进行缺失反应时 ,电泳鉴定发现DNA片段的长度没有明显的变短 ,而在37℃时 ,同一反应体系的DNA片段长度明显缩短 ;进一步用限制性内切酶酶切可筛除PCR中的假阳性 ,获得准确的缺失子。 结论 :质粒的质量是确保进行特异性缺失反应的关键因素 ,通过QIAGEN试剂盒制备的质粒质量较好 ;设立一个37℃缺失对照管可作为判断低温条件下是否发生缺失的标准 ;PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子 ,可确保获得特异的缺失子。

抑制宫颈癌中NGAL基因的表达对癌细胞增殖及凋亡的影响和机制研究

目的探讨抑制宫颈癌中中性粒细胞相关载脂蛋白（NGAL）基因的表达对癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR检测NGAL基因在宫颈癌组织中的mRNA表达;人宫颈癌HeLa细胞分为空白组、阴性对照组和NGAL转染组,转染48 h后,Western bloting检测各组细胞中NGAL、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cleaved caspase3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、β-连环蛋白（β-catenin）、细胞周期素D1（Cyclin D1）蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡情况。结果宫颈癌组织中NGAL的mRNA表达显著高于癌旁组织（P〈0.01）;NGAL转染组NGAL的蛋白表达显著降低;NGAL转染组细胞存活率及Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达均显著低于空白组（P〈0.01）;细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于空白组（P〈0.01）。结论抑制宫颈癌中NGAL基因的表达可显著降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。

RNA干扰NGAL基因表达对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响机制研究

目的分析RNA干扰中性粒细胞相关载脂蛋白(NGAL)基因的表达对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法利用蛋白质印迹(Western Blot)方法检测乳腺癌组织及人乳腺癌MCF-7、T47D和MDA-MB-231细胞株中NGAL的蛋白表达;小干扰RNA(siRNA)-NC及NGAL-siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞,未转染任何siRNA作为对照组,检测转染48 h后各组细胞中NGAL的蛋白表达情况;利用细胞计数试剂盒(CCK8)方法检测细胞的增殖情况;利用流式细胞仪检测细胞的凋亡;利用Western Blot方法检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、磷脂酰肌醇-3(PI3K)、丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)及磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)的蛋白表达情况。结果乳腺癌组织中NGAL的蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.05),NGAL于乳腺癌MCF-7细胞中的蛋白表达最高,选择其作为后续研究;siRNA-NC组NGAL、Cleaved Caspase-3、PI3K及p-AKT蛋白表达和细胞存活率及凋亡率与相应的对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而NGAL-siRNA组NGAL、PI3K和p-AKT蛋白表达及细胞存活率均显著低于相应的对照组(P<0.05),NGAL-siRNA组的细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著高于相应的对照组(P<0.05)。结论 NGAL基因在乳腺癌组织及细胞中高表达,抑制NGAL基因的表达会显著降低细胞增殖及促进细胞凋亡,其机制与PI3K/AKT信号通路的调控有关。

NGAL基因沉默对人卵巢癌细胞株A2780凋亡的影响及机制

目的探讨人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)基因沉默对人卵巢癌细胞株A2780凋亡的影响及机制。方法构建针对NGAL基因的siRNA真核表达载体,转染入A2780细胞中,实验分为3组:空白对照组(Control)、转染NGAL-siRNA沉默组(NGAL-siRNA)和转染阴性对照组(NC-NGAL)。免疫荧光检测NGAL在A2780细胞及IOSE80正常卵巢细胞的表达情况。通过RNA技术沉默NGAL后,运用qRT-PCR及Western blot检测沉默NGAL基因效率。CCK-8法检测细胞活力,TUNEL染色及流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测NF-κB、Caspase-3蛋白表达。结果NGAL在A2780细胞呈高水平表达。NGAL-siRNA组NGAL基因及蛋白表达都受到明显的抑制(P<0.01)。与Control组相比,NGAL-siRNA组细胞凋亡率及Caspase-3蛋白表达明显增加,细胞活力及NF-κB蛋白表达明显下降(P<0.01),而NC-NGAL组各项指标与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默人卵巢癌细胞株A2780中NGAL基因表达,抑制细胞生长并促进细胞凋亡,与上调Caspase-3蛋白表达和下调NF-κB蛋白表达相关。

中性粒细胞相关载脂蛋白在乳腺癌的表达及意义

目的探讨中性粒细胞相关载脂蛋白（NGAL）在乳腺癌的表达及其临床意义。方法乳腺癌手术切除标本47例，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测NGAL mRNA相对表达量；应用免疫组织化学方法，分析NGAL蛋白表达情况。结果乳腺癌组织中NGAL在乳腺癌组织中NGAL mRNA的表达水平为0．42±0．19，显著高于癌旁组织（P〈0．01）；NGAL蛋白在癌组织大多表达为＋＋～＋＋＋水平，癌旁正常组织则大多表达在-～＋水平，NGAL蛋白在癌组织表达显著高于癌旁正常组织（P〈0．01）。NGAL mRNA和蛋白表达与淋巴结转移、病理类型、ER、HER-2状态明显相关（P〈0．05），而与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、PR状态无明显相关（P〉0．05）。结论NGAL的表达与乳腺癌淋巴结转移和内分泌治疗耐药等相关，NGAL可能是乳腺癌早期诊断、监测复发和判断预后的潜在生物学参考指标。