生后不同时期大鼠坐骨神经NGF基因的表达

采用 RT-PCR方法半定量分析生后 1、15、3 0、60、12 0和 3 60 d大鼠坐骨神经中 NGF m RNA表达的变化。结果表明 ,大鼠生后 1d坐骨神经中即有 NGF m RNA的表达 ;随着生后发育过程 ,NGF m RNA的表达量逐步增加 ,并呈严格单调上升的趋势。开始时增加速度较慢 ,但随鼠龄的增加而逐渐加快 ,至 49d时达到最快 ,然后逐渐减慢 ,到 12 0 d时已接近生后稳定表达水平。

NGF及其受体P75在四氯化碳中毒性大鼠肝组织中表达增强

目的观察四氯化碳中毒时神经生长因子(NGF)及其受体P75在大鼠肝组织的表达变化,探讨NGF在肝纤维化发生机制中的可能作用。方法用四氯化碳致大鼠肝中毒模型,用RT-PCR法和Western blot法,分别检测NGF及其受体P75在大鼠肝组织中的表达。结果与对照组大鼠肝组织中NGFmRNA及其受体P75蛋白表达量比较,造模组24 h显著增高(P<0.01,n=6),造模48 h和72 h迅速回降,但仍显著高于对照组(P<0.05,n=6)。结论在四氯化碳中毒性大鼠的肝组织中,NGF及其受体P75的表达可能与肝纤维化的形成密切相关。

DPN大鼠坐骨神经NGF的动态表达及胰岛素和人NGF的干预作用

目的 观察糖尿病多发性神经病 (DPN)大鼠坐骨神经NGF的动态表达以及胰岛素和人神经生长因子(hNGF)的干预作用。方法 以链脲佐菌素 (STZ)诱导糖尿病大鼠模型 ,通过RT PCR和免疫组化技术 ,观察造模后 4和 8周大鼠坐骨神经NGFmRNA和蛋白的表达 ,并观察DPN 4周时用胰岛素或hNGF干预 4周后坐骨神经NGFmRNA和蛋白的表达。结果 NGFmRNA表达在DPN 4周无明显改变 ,8周时明显减少 ;NGF蛋白表达在DPN 4周和 8周均减少。hNGF干预能增加DPN大鼠坐骨神经NGFmRNA和蛋白表达 ,胰岛素则无明显调节作用。结论 DPN大鼠坐骨神经NGF表达减少 ,外源性NGF可弥补这种缺陷。

C_(57)小鼠发育过程中海马NGF基因转录水平的研究(英文)

采用半定量 ＲＴ－ＰＣＲ法测定了１，６，１２月龄 Ｃ５７小鼠海马βＮＧＦ ｍＲＮＡ水平，将β肌动蛋白基因作为内标。结果表明， ６， １２月龄两组间无显著性差异，但均显著低于１月龄组，说明Ｃ５７小鼠发育过程中其海马 βＮＧＦ基因转录水平明显降低。另外，发现Ｃ５７小鼠海马 β ＮＧＦ基因第２９４位碱基为Ｃ，与普通小鼠的Ｔ不同，但这种碱基差异并不影响氨基酸组成。

大鼠坐骨神经损伤后NGF基因表达的变化

目的 探讨大鼠坐骨神经损伤后ＮＧＦ基因表达的变化。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ法，半定量分析坐骨神经横断后１ｄ、１周、２周、４周远侧端组织中 ＮＧＦ ｍＲＮＡ含量的变化。结果 大鼠正常坐骨神经中存在 ＮＧＦ ｍＲＮＡ．但表达量较低。坐骨神经横断后．其远侧端组织中 ＮＧＦ ｍＲＮＡ表达量显著升高，而且呈现一种特殊的“双相增高”现象。结论 坐骨神经损伤后，ＮＧＦ基因的表达呈现出双相增高现象。

不同年龄C_(57)小鼠海马NGF m RNA含量的测定

采用异硫氰酸胍法从C57小鼠海马中分离总RNA ,以肌动蛋白基因为内标用RT PCR法测定不同年龄小鼠海马NGFmRNA含量的变化。C57小鼠海马NGFmRNA含量在 6月龄和 12月龄明显低于 1月龄 ,而 6月龄与

C57小鼠发育过程中海马NGF基因转录水平的研究（英文）

采用半定量 ＲＴ－ＰＣＲ法测定了１，６，１２月龄 Ｃ５７小鼠海马βＮＧＦ ｍＲＮＡ水平，将β肌动蛋白基因作为内标。结果表明， ６， １２月龄两组间无显著性差异，但均显著低于１月龄组，说明Ｃ５７小鼠发育过程中其海马 βＮＧＦ基因转录水平明显降低。另外，发现Ｃ５７小鼠海马 β ＮＧＦ基因第２９４位碱基为Ｃ，与普通小鼠的Ｔ不同，但这种碱基差异并不影响氨基酸组成。

SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1μmol/L和50ng/μL。最佳PCR反应程序为:94℃预变性30s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30s,72℃延伸40s,最后加做熔解曲线82℃1s。结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因。本研究成功建立了2-ΔΔCT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究。

小鼠β-actin基因的RT-PCR克隆与真核表达

以Trizol-异丙醇法提取小鼠肝脏总RNA,根据NCBI数据库中小鼠β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增小鼠β-actin基因编码区并测序;以pcDNA3.1-flag为载体,构建β-actin基因真核表达质粒,继而将其重组产物转染于HeLa细胞,采用Western blot印迹法鉴定重组蛋白pcDNA3.1-flag/β-actin的表达水平。结果表明：克隆获得的289 bp片段与NCBI数据库中β-actin基因序列完全吻合,并且成功构建的pcDNA3.1-flag/β-actin真核基因表达载体,其重组质粒可在HeLa细胞中有效表达约43×10^3KD融合蛋白。

NGF mRNA在来航鸡体内主要器官中的表达

为了探讨神经生长因子对鸡的生长发育的影响,试验以2月龄来航鸡为试验对象,经RTPCR方法检测鸡体内主要器官中NGF mRNA的表达情况。结果表明:鸡体内主要器官中均有NGF mRNA的表达,并且在肺脏表达量最高,心脏、胰腺和胸腺次之。说明NGF在鸡体内主要器官的广泛表达预示着NGF参与鸡体各系统的发育过程,但具体作用机制还有待深入研究。

番鸭IFN-α mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭IFN-α基因（GenBank登录号：JF894229）序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因（GenBank登录号：GU564232）为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法（RT-PCR）。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品（p-IFN-α和p-β-actin）,分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99（r〉0.99）,扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为（93.6±0.26）℃和（85.3±0.15）℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。

桃小食心虫总RNA的有效提取与β-actin基因的克隆

根据桃小食心虫幼虫、蛹、成虫3种虫态各自形态及生理特点,克服了幼虫和蛹的几丁质、糖含量较高,成虫鳞片较多的特点,探讨3种虫态总RNA的提取方法;设计该物种β-actin基因的简并引物并对其产物克隆测序。结果表明:提取获得的RNA可以满足RT-PCR等后续试验需要;β-actin基因在桃小食心虫幼虫、蛹、成虫3种虫态中表达稳定;首次获得了桃小食心虫的β-actin基因序列(Genbank:KJ002793)。

气态甲醛暴露对神经生长因子表达影响的体内实验

为了探讨气态甲醛对小鼠组织中NGF表达的诱导作用,以小鼠肺和脑作为实验材料,应用RT-PCR方法检测甲醛染毒后小鼠肺和脑中NGF-mRNA的表达量.结果显示,小鼠脑中NGF表达量随着染毒时间的增加而增加;而肺中NGF在甲醛染毒1d后就达到最大,但随着时间的增加NGF表达量反而下降;故NGF在小鼠这2种组织中呈现不同的表达效应.为了进一步研究甲醛、NGF和哮喘之间的联系,构建了大鼠的哮喘模型,应用RT-PCR方法检测哮喘模型鼠肺中NGF的表达趋势.结果显示,在大鼠哮喘模型中,低浓度甲醛组(1.0mg·m-3)NGF表达量显著上调(p<0.01),而高浓度甲醛组(3.0mg·m-3)NGF表达量反而下降,仅略高于空白对照组(p>0.05).

吸入甲醛对小鼠前脑NMDA-R基因转录的影响

通过测定小鼠前脑N—甲基—D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDA-R)的转录水平的变化,研究中低浓度甲醛暴露环境对小鼠中枢神经系统的影响.实验以昆明系小鼠为实验材料,经甲醛染毒后,立即脱颈处死并取其前脑组织提取总RNA,采用RT-PCR二步法对其中的NMDA-R亚基(Grin1,Grin2a,Grin2b)及管家基因β-actin进行扩增,通过光密度分析染毒前后基因转录水平的变化.实验结果表明,与对照组相比,0.5mg·m-3浓度的气态甲醛可使Grin1基因转录稍有上调,但无显著性差异;Grin2a基因转录上调且有显著性差异(p<0.05),Grin2b基因略有下调但无显著性差异.3.0mg·m-3浓度的甲醛可使Grin1基因转录上调并具有极显著差异(p<0.01),且上调幅度明显大于0.5mg·m-3染毒组;Grin2a基因转录显著性上调(p<0.05),但上调幅度小于0.5mg·m-3染毒组;Grin2b基因转录显著性下调(p<0.05).由此可见,低浓度甲醛(0.5mg·m-3)的吸入对NMDA-R(除Grin2a外)的各亚基的影响较小.中等浓度甲醛(3.0mg·m-3)的吸入对NMDA-R影响较大,这可能是持续性气态甲醛吸入对小鼠中枢神经系统产生影响的重要机制之一.

柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体TNF-α基因表达动态的关系

根据GenBank上鸡β-actin、TNF-α的基因序列设计引物,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆获得了β-actin和TNF-α基因,采用β-actin为内参的半定量方法检测TNF-αmRNA在鸡柔嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况,以探讨TNF-α基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系。结果显示,TNF-α基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式,首免后第9 d达到一个高峰,二免后第7d达到另一个高峰。结果表明,TNF-α在抗球虫感染中有一定的作用。

丹参素和川芎嗪对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大相关基因的影响

目的通过研究活血药的提取物丹参素和川芎嗪对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌肥大及相关基因的影响,探讨其抑制心肌肥大的作用机理。方法以心钠素(ANP)和肌动蛋白- β(β- actin)基因表达为指标,采用一步法,应用TRIzolReagent提取心肌细胞总RNA ,然后用RT PCR方法测定其ANP、β- actin的mRNA表达。结果分子生物学研究表明,AngⅡ可显著增加心肌细胞ANPmRNA的表达(P <0 . 0 1) ,而Losartan可明显抑制AngⅡ所诱导的ANPmRNA的表达(P <0 . 0 1) ,丹参素和川芎嗪也可减少ANPmRNA的表达(P <0 . 0 5 ) ;AngⅡ同时也增加心肌细胞-βactinmRNA的表达,而Losartan、丹参素和川芎嗪可显著抑制其表达(P <0 .0 5 )。结论活血药的有效组分丹参素和川芎嗪可抑制AngⅡ对心肌细胞ANP和β-actin基因表达的增加,具有防止心肌细胞肥大作用,从而防治心脏肥厚。

长链非编码RNA XLOC_004122 对肺结核预后的辅助诊断价值

目的探讨XLOC_004122在结核患者支气管肺泡灌洗液中的表达及其对预后的判断价值。方法收集本院2014年10月-2015年3月结核科患者支气管肺泡灌洗液标本45例,利用RT-PCR技术测定每名患者灌洗液标本中XLOC_004122及内参β-actin的表达,并计算XLOC_004122/β-actin(相对定量)的均值。将XLOC_004122相对定量值大于均值的患者设定为XLOC_004122高表达组,XLOC_004122相对定量值小于等于均值的患者设定为XLOC_004122低表达组。结合患者的临床症状、体征、实验室检查、影像学检查等比较两组结核病治疗的预后。结果 XLOC_004122低表达组痰培养转阴率显著高于高表达组(3周转阴率:75%vs 39%,P<0.05),同时XLOC_004122低表达组痰菌量显著低于高表达组(3周痰菌量对数:0.78±0.03 vs 1.33±0.05,P<0.05)。结论 XLOC_004122有成为结核预后指标的潜力。

针刺对脑梗死大鼠骨骼肌α-actin mRNA表达的影响

目的观察头针加体针对脑梗死大鼠骨骼肌α-actin m RNA表达的影响,初步探讨针刺对脑梗死偏瘫骨骼肌的作用机制。方法按时相在规定的骨骼肌部位取材并标记,采用定量法提取骨骼肌RNA、通过荧光定量qRT-PCR检测,观察大鼠患侧骨骼肌中α-actin m RNA的表达变化。结果 A、B、C三组的前肢肌、腓肠肌、腰大肌中α-actin m RNA表达与D、E组相比较均有明显的变化,且C组在0h、24h、48h时与其他组比较,基因表达均有显著差异性(P﹤0.001),B组与A、D、E比较,在0h,24h有显著性差异(P﹤0.05),A组与D、E组在48h有显著性差异(P﹤0.05),且在48h时α-actin在腰大肌中的表达最强,有显著性差异(P﹤0.01)。结论头针加体针可上调脑梗死大鼠早期骨骼肌中α-actin m RNA表达,且在48h时α-actin在腰大肌中的表达最强,这可能是针刺改善脑梗死偏瘫骨骼肌肌力的作用途径之一。

一种改良的半定量RT PCR方法

选用细胞因子ＩＬ４ 为靶基因， 以β肌动蛋白（βａｃｔｉｎ） 基因作为内参照， 将两者在同一ＰＣＲ体系中扩增， 分析ＰＣＲ扩增的动力学， 内参照βａｃｔｉｎ 的引物于ＰＣＲ扩增中的滞后加入， 弥补了ＩＬ４ 与ＲＴＰＣＲ模板量的差异， 使二者的扩增同时处于指数扩增期， 其扩增产物均可在溴乙锭染色的聚丙烯酰胺胶上检测出， 从而可求出ＩＬ４ 的ｃＤＮＡ 拷贝数占βａｃｔｉｎ拷贝数的百分比。重复实验的ＣＶ 值在１０％ 以内， 表明此半定量ＲＴＰＣＲ 方法的可靠性。

胃癌组织中血管内皮生长因子C表达及与淋巴结转移关系

目的探讨胃癌组织中血管内皮生长因子C(VEGFC)的表达及与肿瘤淋巴结转移的关系。方法取30例胃癌患者手术切除的新鲜标本和距癌灶5cm以外的胃组织各1块,采用半定量RTPCR法和免疫组化染色法检测胃癌组织及癌旁正常组织的VEGFC表达,图像分析仪检测VEGFC的免疫组化阳性指数(positiveindex,PI)。结果胃癌细胞呈高水平表达VEGFC,癌旁正常组织则未见表达。在胃癌组织中,有淋巴结转移(PI=1.345±0.079)、淋巴管浸润(PI=1.315±0.037)患者的VEGFC表达水平分别较无转移(PI=1.156±0.045)及无浸润者(PI=1.154±0.043)增高(P<0.05)。高分化胃癌患者的VEGFCmRNA[VEGFC/βactin比值(Ar)=0.846±0.042]和VEGFC表达(PI=1.372±0.023)均分别高于中低分化胃癌者(Ar=0.663±0.007,P<0.01和PI=1.126±0.078,P<0.05)。结论VEGFC阳性表达的胃癌患者可能更易发生淋巴结转移。